貝類中諾如病毒的快速檢測(cè)及超高壓滅活研究.pdf

1、諾如病毒(norovirus，NoVs)是一組形態(tài)和生物學(xué)特征類似的無包膜的正鏈RNA病毒的統(tǒng)稱，屬于杯狀病毒，是引起人類急性胃腸炎的重要病原，近年來在包括中國在內(nèi)的世界多個(gè)國家和地區(qū)均有諾如病毒爆發(fā)和散發(fā)病例報(bào)道。由于該病毒多以食物尤其是濾食性雙殼貝類如牡蠣等水產(chǎn)品作為傳播載體，加之人們生食貝類的習(xí)慣由來已久，由貝類中的諾如病毒引起的食品安全性問題越來越受到世界各國的重視。開展貝類中諾如病毒的快速檢測(cè)及滅活研究，對(duì)保障我國人民食品安全

2、，提高出口食品質(zhì)量以及創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值都至關(guān)重要。
　　 諾如病毒的檢測(cè)和研究一度因?yàn)闊o法實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)而局限于電鏡等成本高、靈敏度低的手段，其后發(fā)展起來的免疫學(xué)方法也因特異性太強(qiáng)而應(yīng)用范圍較窄。近年來，隨著部分諾如病毒毒株的全基因序列的測(cè)定與分析，以及大量毒株部分序列的獲得，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)以其快速、靈敏等優(yōu)勢(shì)得到了廣泛的應(yīng)用。
　　 本論文采用諾如病人腹瀉糞便與牡蠣勻漿混合的方法，建立了攜帶諾如病毒的貝類模型。采用

3、RT-PCR，RT-seminested PCR，RT-Real Time PCR和RT-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(KT-loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP)等分子生物學(xué)方法，分別檢測(cè)貝類中的諾如病毒，并對(duì)幾種方法進(jìn)行綜合分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：牡蠣中存在的抑制物使得常規(guī)PCR的靈敏度和特異性不理想，一步法相比于兩步法電泳條帶清晰且消除了非特異性擴(kuò)增，但對(duì)于稀釋度大于100倍的樣品仍然不能檢出

4、。Seminested PCR較常規(guī)PCR大大提高了檢測(cè)靈敏度。但該方法操作過程比較繁雜，需要的實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長，影響了該方法的普及。熒光定量PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)諾如病毒的定量分析，而且大大提高了檢測(cè)和定性分析靈敏度，自動(dòng)化程度更高。但是該方法需要熒光定量PCR儀，所用試劑也較為昂貴，難以在基層單位推廣。RT-LAMP具有方便快捷、成本低等特點(diǎn)，具有很強(qiáng)的可操作性及適用性，有望成為簡易的常規(guī)檢測(cè)手段。
　　 雖然傳統(tǒng)的加熱烹調(diào)方法能夠

5、有效地滅活食物中的諾如病毒，但隨著生鮮即食食品尤其是牡蠣等生食海產(chǎn)品的普及，一種全新的滅活加工手段亟待建立。超高壓技術(shù)作為一種有效的滅菌消毒的物理手段已成功地應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，因其能夠很好地保持食品原有的營養(yǎng)價(jià)值、色澤和天然風(fēng)味，在生食貝類等水產(chǎn)品的加工方面具有非常好的應(yīng)用前景。
　　 本論文利用鼠諾如病毒(Murine norovims-1，MNV-1)作為研究替代物，建立了海水流動(dòng)系統(tǒng)模擬貝類富集諾如病毒的模型，通過空斑實(shí)驗(yàn)評(píng)

6、價(jià)了超高壓技術(shù)對(duì)牡蠣體內(nèi)諾如病毒的滅活效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：0℃下200 MPa處理5min即可對(duì)牡蠣體內(nèi)的MNV-1產(chǎn)生滅活效果，400 MPa處理5min可使牡蠣體內(nèi)的MNV-1活力降至無檢出水平。
　　 綜合采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)超高壓滅活鼠諾如病毒的作用機(jī)制進(jìn)行一系列初步的探討。針對(duì)病毒基因組不同區(qū)域設(shè)計(jì)三對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而判斷病毒在經(jīng)過高壓處理后核酸的完整性；通過酶處理-RT-PCR、抗原捕獲-RT-PCR以及

7、酶聯(lián)免疫的方法，分別探討了病毒外殼蛋白對(duì)于核酸的保護(hù)能力、病毒外殼上抗原決定簇的變化以及病毒外殼上連接受體分子的結(jié)構(gòu)變化情況；采用免疫細(xì)胞化學(xué)和酶聯(lián)免疫的方法探討滅活后的病毒是否仍然能與細(xì)胞上的受體結(jié)合從而啟動(dòng)整個(gè)感染過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：超高壓對(duì)于MNV-1感染性的影響作用在與細(xì)胞上受體的粘附階段；超高壓處理后，MNV-1抗原性及RNA的完整性沒有受到明顯的破壞，但MNV-1蛋白外殼對(duì)殼內(nèi)RNA的保護(hù)能力明顯下降。
　　 環(huán)介導(dǎo)