貝類中諾如病毒的風(fēng)險(xiǎn)評估及與組織血型抗原相關(guān)性.pdf

1、諾如病毒(Noroviruses,NoVs)是引起世界范圍內(nèi)非細(xì)菌性急性腸胃炎的主要病原體,貝類是其最主要的傳播載體。人們通常由于食用了生的或者加熱不徹底的海產(chǎn)貝類而感染NoVs,并引起急性腸胃炎。我國是世界水產(chǎn)大國,貝類年產(chǎn)量1000多萬噸,在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有較重要的地位,NoVs作為貝類中常見的食源性致病微生物是質(zhì)量安全一個(gè)不容忽視的問題。然而,NoVs尚不可體外培養(yǎng),貝類中因NoVs含量少、存在PCR抑制劑多等原因給檢測帶來困難

2、,我國尚未建立貝類中NoVs檢測的國家標(biāo)準(zhǔn);研究表明組織血型抗原是人體感染NoVs的受體,牡蠣中也存在類似的受體,但牡蠣中該受體與NoVs的相關(guān)性及其對牡蠣富集NoVs的影響尚不清楚。因此建立貝類中NoVs的富集檢測方法,調(diào)查我國主要沿海地區(qū)貝類中NoVs的分布情況以及開展貝類中NoVs的風(fēng)險(xiǎn)評估;研究牡蠣中NoVs與組織血型抗原相關(guān)性,探索牡蠣等貝類富集NoVs的機(jī)理,對于保護(hù)消費(fèi)者健康,保障我國貝類產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要的意義。

3、
　　本文以貝類中NoVs為研究對象,優(yōu)化建立了海產(chǎn)貝類中GI和GII型NoVs的富集方法,調(diào)查了黃渤海區(qū)7個(gè)城市零售海產(chǎn)貝類中NoVs的污染狀況,在上述研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合CAC的食品安全風(fēng)險(xiǎn)分析理論,開展貝類中NoVs的風(fēng)險(xiǎn)評估研究;針對NoVs受體,建立了太平洋牡蠣中A型組織血型抗原的ELISA檢測方法,并調(diào)查了威海、青島、日照3個(gè)城市太平洋牡蠣樣品中A型組織血型抗原隨季節(jié)的變化規(guī)律;利用 RACE技術(shù)得到了一個(gè)太平洋牡蠣組織

4、血型抗原合成相關(guān)基因FUT3的cDNA全長,并進(jìn)行了原核表達(dá);利用牡蠣全基因組序列,初步探索了溫度對牡蠣組織學(xué)型抗原合成關(guān)鍵基因 FUT2的表達(dá)調(diào)控。具體研究結(jié)果如下:
　　1.貝類中NoVs富集方法的建立和優(yōu)化
　　通過人工污染實(shí)驗(yàn),向牡蠣和菲律賓蛤仔的消化道勻漿物中分別添加不同濃度的GI.3和 GII.4型NoVs,利用4種貝類中NoVs富集方法分別回收病毒,用實(shí)驗(yàn)室前期建立的real-time RT-PCR方法進(jìn)行檢測

5、。以4種方法從牡蠣和菲律賓蛤仔中富集GI.3和 GII.4型NoVs的富集效率評價(jià)4種方法的優(yōu)劣,同時(shí)分析影響NoVs富集的主要因素。結(jié)果顯示方法B(Proteinase K-PEG8000)操作簡單,耗時(shí)較短,且穩(wěn)定性和靈敏性均優(yōu)于其他方法,其從牡蠣和菲律賓蛤仔中富集GI.3型NoVs的富集效率分別為9.3％和9.6%,對GII.4型NoV的富集效率分別為13.1%和12.3%,比其他三種方法的富集效率高(p<0.05)。研究結(jié)果還發(fā)

6、現(xiàn)貝類品種及貝類中NoVs的含量是影響貝類中NoVs富集效率的主要因素。
　　2.黃渤海貝類中NoVs污染狀況調(diào)查
　　從2009年12月至2011年11月,采集了大連、萊州、煙臺(tái)、威海、青島、日照、連云港7個(gè)黃渤海區(qū)沿海城市6種零售貝類樣品840個(gè)。調(diào)查結(jié)果顯示NoVs在6種貝類中均有檢出,平均檢出率為13.33%(112/840)。不同貝類中NoVs的檢出率為:牡蠣19.35%,紫貽貝16.67%,扇貝5.70%,縊蟶8

7、.82%,毛蚶13.74%,菲律賓蛤仔16.44%。貝類中NoVs的季節(jié)分布結(jié)果顯示,夏季貝類中NoVs檢出率最高,為16.44%,冬季和秋季次之,春季最低。此外,研究發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)NoVs檢出率存在明顯的品種特異性差異。春季和冬季牡蠣樣品中 NoVs的檢出率最高,夏季毛蚶樣品中NoVs的檢出率最高,而冬季菲律賓蛤仔中NoVs的檢出率最高。在冬季采集的33個(gè)扇貝樣品中,NoVs無檢出。
　　定量結(jié)果顯示,112個(gè)陽性貝類樣品中,96

8、個(gè)樣品中NoVs含量<103基因拷貝。運(yùn)用spss17.0軟件對不同貝類品種和不同季節(jié)貝類中NoV污染水平進(jìn)行分析,非參檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H tests)結(jié)果顯示不同貝類品種和不同季節(jié)貝類中NoV污染水平均無明顯差異(p>0.05)。112個(gè)陽性樣品中,普通RT-PCR復(fù)檢中僅96個(gè)樣品瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶。將這96個(gè)樣品測序結(jié)果輸入 Norovirus Genotyping Tool Version1.0軟件后

9、,結(jié)果顯示94個(gè)NoV屬于GII.12變異株,2個(gè)屬于GI.3。在冬季采集的菲律賓蛤仔和毛蚶中檢測到GI.3型NoV。
　　3.貝類中NoVs的風(fēng)險(xiǎn)評估
　　本研究針對上述情況,利用前期調(diào)查研究獲得的貝類中NoVs污染狀況數(shù)據(jù)和相關(guān)膳食調(diào)查數(shù)據(jù),對我國海產(chǎn)貝類中NoVs進(jìn)行了定量風(fēng)險(xiǎn)評估,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國沿海城市居民食用貝類引發(fā)腸胃炎的平均概率為4.08E-7,預(yù)計(jì)每年0-4歲、5-64歲和65歲以上人口的發(fā)病數(shù)分別為119

10、、9078和339人。本次評估只考慮貝類中NoVs污染率和污染水平以及貝類攝入量對風(fēng)險(xiǎn)的影響,存在一定的不確定性。國內(nèi)外有關(guān)貝類中NoVs風(fēng)險(xiǎn)評估的研究較少,本次評估可以為貝類或其他食品中NoVs的風(fēng)險(xiǎn)評估提供一定的參考,相關(guān)調(diào)查資料可以為貝類食用安全提供指導(dǎo)意義。
　　4.牡蠣組織血型抗原的檢測
　　在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上改進(jìn)前處理方法,建立了太平洋牡蠣中A型組織血型抗原的ELISA檢測方法。運(yùn)用建立的ELISA方法和第

11、二章建立的貝類中NoVs的富集方法對2010年從威海、青島、日照3個(gè)城市采集的36份太平洋牡蠣進(jìn)行了A型組織血型抗原和NoVs的檢測,結(jié)果表明三個(gè)城市太平洋牡蠣中A型組織血型抗原隨季節(jié)變化呈現(xiàn)波動(dòng)性變化,在全年不同月份出現(xiàn)峰值;36份牡蠣樣品檢出NoVs陽性6份,檢出率為16.7%,且檢出時(shí)間出現(xiàn)在A型組織血型抗原的高峰值處,推測貝類受NoVs污染可能與組織血型抗原表達(dá)相關(guān)。
　　5.牡蠣組織血型抗原相關(guān)基因的克隆及原核表達(dá)

12、>　　參照人體組織血型抗原合成途徑,選擇 FUT2基因作為牡蠣組織血型抗原合成關(guān)鍵基因。由于當(dāng)時(shí)牡蠣全基因組序列尚未公布,通過Clustal X與Mega等分析軟件,分析人、猩猩、小鼠、家犬等物種的FUT2基因氨基酸序列,推測牡蠣FUT2的保守區(qū),根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物。利用PCR方法擴(kuò)增牡蠣組織血型抗原合成相關(guān)基因得到預(yù)期片段488 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,通過牡蠣“FUT2”擴(kuò)增片段與人、小鼠、猩猩等物種的序列比對分析,可以初步證實(shí)牡蠣證實(shí)在

13、牡蠣基因組中存在FUT2基因的保守片段。根據(jù)PCR方法得到的牡蠣“FUT2”的部分序列,設(shè)計(jì)引物,利用 RACE擴(kuò)增技術(shù)對牡蠣基因組進(jìn)行擴(kuò)增,克隆測序得到牡蠣“FUT2”基因3’和5’端序列,序列拼接后得到1086bp的cDNA全長基因。2012年9月,太平洋牡蠣全基因組序列公布,通過比對發(fā)現(xiàn)得到的牡蠣“FUT2”蛋白序列與FUT3基因同源性為98%,而與牡蠣FUT2基因的同源性為36%,因此證實(shí)所得序列為太平洋牡蠣FUT3基因。在此基

14、礎(chǔ)上,通過構(gòu)建表達(dá)載體,成功誘導(dǎo)出 FUT3的蛋白,大小為41.5kDa,為后續(xù)FUT3基因的功能驗(yàn)證打下基礎(chǔ)。
　　6.溫度對牡蠣組織血型抗原的表達(dá)調(diào)控
　　以β-actin作為內(nèi)參基因,建立太平洋牡蠣中FUT2基因的熒光定量 PCR檢測方法。用高溫(28℃)和低溫(4℃)處理太平洋牡蠣,分別于48 h和72 h取樣,研究牡蠣外套膜、閉殼肌、鰓和內(nèi)臟4個(gè)組織中7組FUT2基因的表達(dá)情況。熒光定量PCR研究結(jié)果表明溫度對FU