空腸彎曲桿菌中Cas9基因與毒力的關(guān)系研究.pdf

1、近年來由空腸彎曲桿菌感染引起的人類及動物性疾病越來越多，為了更好的預(yù)防和控制疾病的產(chǎn)生，必需更加清楚的了解致病菌毒性產(chǎn)生的機(jī)制和原因。另外由CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)和Cas基因(CRISPR-associated)組成的CRISPR-Cas系統(tǒng)作為細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，被發(fā)現(xiàn)其與細(xì)菌的毒力有密切的相關(guān)性。CRISPR-Cas系統(tǒng)通

2、過整合外源的DNA進(jìn)入CRISPR序列中，來識別二次入侵的外源DNA從而將外源DNA降解，達(dá)到抵抗外源可遺傳物質(zhì)入侵的目的。既然CRISPR-Cas系統(tǒng)可以阻止外源DNA對自身的損害，那么CRISPR-Cas系統(tǒng)是否也可以使細(xì)菌能夠更快或更慢的進(jìn)入到其他的生物體中。近十年來，CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在不同的生物體中被應(yīng)用。雖然CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯技術(shù)在不同的生物體中都被應(yīng)用，但

3、是它對細(xì)菌的作用，卻還停留在適應(yīng)性免疫防御的作用，對細(xì)菌毒力方面的作用，目前還很少有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。所以本課題研究的目的是了解肉雞空腸彎曲桿菌NCTC11168中Cas9基因和毒力之間的關(guān)系。主要從兩個(gè)方面來探討Cas9和毒力的關(guān)系，一方面從毒力表型考察，另一方面從毒力基因型探討。通過結(jié)合這兩個(gè)方面，全面了解Cas9和細(xì)菌毒力的關(guān)系，從而為解決空腸彎曲桿菌的風(fēng)險(xiǎn)管理和危害控制提供更多的理論依據(jù)。
　　采取融合PCR技術(shù)構(gòu)建同源重組

4、載體。在Cas9基因的上游和下游各擴(kuò)增1300bp左右的片段，并擴(kuò)增出Kan基因，大小約1200bp作為篩選基因，然后將這三個(gè)片段按照融合PCR的方法以上游片段-Kan基因-下游片段的順序連接起來，最后再連接到pGEM-Teasy載體上，構(gòu)建出同源重組載體p3HKan5H。將p3HKan5H載體通過電轉(zhuǎn)化和自然轉(zhuǎn)化進(jìn)入空腸彎曲桿菌NCTC11168中，篩選出突變菌，并進(jìn)行突變體的驗(yàn)證。
　　測定野生菌與突變菌的生長能力、鞭毛的形態(tài)

5、和遷移力、生物膜的情況，來考察Cas9基因?qū)?xì)菌自身毒力表型的影響。測定的生長力的結(jié)果顯示:采用t檢測的方法考察，野生型菌與突變菌的生長力并沒有顯著性差異。遷移力的結(jié)果顯示:野生型菌的遷移力明顯比突變菌強(qiáng)，兩者之間存在著顯著的差異性。遷移力主要與細(xì)菌的鞭毛運(yùn)動有關(guān)，既然遷移力有顯著的差異性，可能Cas9基因?qū)?xì)菌的鞭毛有一定的作用。所以采用冷凍透射電鏡觀察鞭毛的形態(tài)，觀察其是否有顯著的變化，但是結(jié)果顯示，野生型菌與突變菌的兩極都存有較長

6、的且完整的鞭毛，說明敲除Cas9基因后，鞭毛的形態(tài)并沒有發(fā)生顯著變化。生物膜結(jié)果顯示:突變菌的生物膜的形成能力比野生菌的弱。可以初步說明Cas9基因?qū)漳c彎曲桿菌的毒力是有一定的影響的。
　　測定了細(xì)菌本身的毒力變化外，還需要對細(xì)菌的體外毒性進(jìn)行檢測，包括檢測菌株對細(xì)胞的侵襲力和粘附力，以及菌株在體外的生存能力。實(shí)驗(yàn)采用鼠源的巨噬細(xì)胞RAW264.7和結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2，采用慶大霉素保護(hù)法對野生型菌和突變菌進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)

7、果顯示，敲除Cas9基因后，對粘附力和侵襲力并沒有顯著性差異，但對細(xì)胞內(nèi)的生存能力具有顯著性差異，表現(xiàn)出減弱的趨勢。
　　采用MTT實(shí)驗(yàn)方法來測定細(xì)菌的毒力產(chǎn)生能力，通過測定細(xì)菌的產(chǎn)毒能力，來檢測細(xì)菌的致病性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩者之間有顯著的差異性且野生菌比突變菌的產(chǎn)毒能力強(qiáng)，說明敲除Cas9基因后，細(xì)菌的產(chǎn)毒能力下降。
　　本實(shí)驗(yàn)采用第二代測序技術(shù)(Next-Generation Sequencing，NGS)，基于Illu

8、mina NextSeq500測序平臺，對構(gòu)建的文庫進(jìn)行雙末端(Paired-end，PE)測序。RNA-Seq的主要目的是檢測敲除Cas9基因后，有哪些毒力基因會發(fā)生變化，從而找出Cas9基因與這些毒力基因的關(guān)系。
　　總得來說，表型結(jié)果顯示，△Cas9突變體與野生型菌相比，在遷移力、生物膜的形成能力、細(xì)胞內(nèi)的生存能力以及產(chǎn)毒能力這四個(gè)方面均表現(xiàn)出減弱。毒力基因型方面，RNA-Seq結(jié)果顯示，所有的差異基因中，只有被敲除的Cas