熒光免疫吸附法檢測食品中過敏原α-乳白蛋白的研究.pdf

1、牛乳及其乳制品中含有豐富的蛋白質(zhì),深受人們的青睞,尤其對嬰幼兒和老年人來說,是日常生活中主要的營養(yǎng)物質(zhì)來源,同時,牛乳又是主要的過敏食物之一。調(diào)查表明,牛乳過敏在人群中的發(fā)病率為0.3-7.5％,其中一歲以下嬰幼兒中的發(fā)病率達(dá)到2-3%。牛乳中α-乳白蛋白屬于溶菌酶家族,是導(dǎo)致牛乳過敏的主要過敏原蛋白之一,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),超過51%的牛乳過敏是由α-乳白蛋白引起的。牛乳中α-乳白蛋白與人乳中α-乳白蛋白的同源性約為74%,另有6%的氨基酸

2、殘基化學(xué)性質(zhì)相似,營養(yǎng)價(jià)值高、但致敏性強(qiáng),而牛乳常作為原料用于各種食品,所以開展針對食品中α-乳白蛋白的檢測具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本研究主要包括牛乳α-乳白蛋白的分離純化、抗牛乳α-乳白蛋白單克隆抗體的制備及純化、量子點(diǎn)偶聯(lián)標(biāo)記單克隆抗體以及食品中過敏原α-乳白蛋白檢測方法的建立。主要研究內(nèi)容如下:
　　 (1)采用DEAE-Sepharose Fast Flow弱堿性陰離子交換樹脂結(jié)合Sephadex G-

3、75凝膠過濾層析法分離純化牛乳中α-乳白蛋白,利用SDS-PAGE電泳和灰度掃描表征所得蛋白的純度,并采用lowry法測定蛋白濃度,結(jié)果表明:得到的α-乳白蛋白純度大于95%,得率約為20.5%。
　　 (2)以純化的α-乳白蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠,利用間接ELISA法監(jiān)測免疫小鼠血清效價(jià),當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到1:10.0000時,宰殺小鼠并取其脾臟細(xì)胞。小鼠脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞融合后經(jīng)顯微鏡觀察,細(xì)胞融合率＞70%,篩選融合細(xì)

4、胞孔,結(jié)果顯示陽性孔約3%,得到的單克隆抗體腹水效價(jià)約3×105。采用辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法純化腹水中單抗,SDS-PAGE電泳表征單抗純度,同時采用間接競爭ELISA、免疫印跡檢測單抗活性及特異性,結(jié)果顯示所得腹水經(jīng)純化后保證了單克隆抗體的活性且特異性好,與牛乳中其它主要過敏原無交叉反應(yīng)。
　　 (3)以純化的單克隆抗體與熒光量子點(diǎn)進(jìn)行偶聯(lián),通過反應(yīng)物配比的優(yōu)化,確定量子點(diǎn)、EDC、NHS、單克隆抗體摩爾比為1:10:6:4時

5、有較好的偶聯(lián)效果。采用Sephadex-G200凝膠層析柱純化偶聯(lián)產(chǎn)物,再借助熒光分光光度計(jì)分析純化產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)后量子點(diǎn)最大發(fā)射峰藍(lán)移3 nm,證實(shí)偶聯(lián)過程的可行性。同時,利用斑點(diǎn)印跡顯示已偶聯(lián)量子點(diǎn)的抗體可與α-乳白蛋白結(jié)合,并在紫外成像系統(tǒng)下產(chǎn)生熒光,說明單抗偶聯(lián)量子點(diǎn)后仍保留較強(qiáng)的免疫活性。
　　 (4)建立了檢測α-乳白蛋白的間接競爭FLISA方法,同時確定的工作條件如下:包被抗原濃度為1μg/mL,抗體稀釋倍數(shù)為1: