基于蛋白質(zhì)和dna的食品過敏原檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

1、中國釀造2017年第36卷第7期總第305期食品過敏是致敏機(jī)體在再次受到食品中同種抗原刺激時(shí)引起的不良免疫反應(yīng)。食品過敏反應(yīng)通常由免疫球蛋白E（immunoglobulinE，IgE）介導(dǎo)，主要分為致敏和發(fā)敏兩階段。在機(jī)體初次受食品中抗原刺激后會(huì)產(chǎn)生抗原特異性IgE，并與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次接觸同一食品抗原后，會(huì)在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面通過交聯(lián)抗原特異性IgE產(chǎn)生過敏反應(yīng)，使得大量

2、蛋白水解酶、白三烯或促炎細(xì)胞因子釋放，引起過敏癥狀。致敏個(gè)體由于過敏原的攝入而產(chǎn)生的臨床癥狀包括蕁麻疹、瘙癢、水腫、支氣管痙攣、鼻炎、嘔吐、腹瀉、痙攣，甚至致命的過敏性休克[12]。目前，食品過敏被世界衛(wèi)生組織納入五個(gè)最重要的公共健康問題之一，特別是在工業(yè)國家，有2%成年人和4%～8%幼兒受其影響。由于不同地區(qū)飲食習(xí)慣的不同，食品過敏的發(fā)病率和患病率還在不斷增加。在已確認(rèn)的可引起過敏反應(yīng)的160多種食物中，有8種被認(rèn)為與90%食物過敏有

3、關(guān)。這些“主要的食品過敏原”包括牛奶、蛋類、魚、甲殼動(dòng)物貝類、堅(jiān)果、小麥、花生和大豆[34]。為保護(hù)消費(fèi)者安全及向消費(fèi)者提供更多信息，多國立法規(guī)定食品包裝袋上需要標(biāo)注過敏原。另一方面，提高現(xiàn)有食品過敏原的檢測分析方法，并制定新的標(biāo)準(zhǔn)化方法，為食品和餐飲業(yè)提供適當(dāng)?shù)墓ぞ咭约盀椤笆称愤^敏”消費(fèi)者提供“無過敏原”食品也是避免食物過敏重要的途徑。本文對(duì)基于蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）的檢測方法在食品過

4、敏原檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，如免疫化學(xué)法、蛋白質(zhì)組學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）等，及對(duì)食品過敏原檢測方法的發(fā)展進(jìn)行了探討。1食品過敏原成分檢測的靶目標(biāo)分子食品過敏原成分檢測主要依賴于過敏原自身或過敏原成分的標(biāo)記分子。通常有兩類標(biāo)記分子用于檢測過敏原：過敏原成分中的特征性蛋白和能表征過敏成分的特定的DNA序列。由于蛋白靶標(biāo)和DNA靶標(biāo)各有利弊，因此應(yīng)根據(jù)食品自身進(jìn)行選擇。一般選擇某種靶分子

5、的重要依據(jù)在于其在樣品中的豐度，這將影響到檢測方法的靈敏性。蛋白同源性也是重要參考因素，當(dāng)選擇某種蛋白作為靶分子檢測不同物種中的過敏原時(shí)，應(yīng)選擇保守性較高的同源蛋白。盡管蛋白檢測方法比較常用，但蛋白成分容易受到食品加工和外界變化的影響，如季節(jié)和地理的影響；熱加工也會(huì)降低目的蛋白溶解度。而DNA分子則具有更好的穩(wěn)定性，且不受表型變異影響，因此更有助于定量分析及用于對(duì)敏感性要求較高的場合。在DNA靶標(biāo)中，常用的靶向分子包括單拷貝或多拷貝分子

6、，如線粒體、葉綠體或其他高度重復(fù)序列。由于多拷貝分子在樣品中數(shù)量較多，其可提高分析敏感性，而單拷貝基于蛋白質(zhì)和DNA的食品過敏原檢測技術(shù)的研究進(jìn)展丁亮，付琳，吳秀蓮，李夢雪（南京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局高淳區(qū)質(zhì)量計(jì)量檢測所，江蘇南京211300）摘要：目前，食品過敏問題已成為全球性的健康問題。在食品加工過程中產(chǎn)生的食品過敏成分或微量過敏原對(duì)敏感機(jī)體都是巨大的健康威脅。因此，可靠的分析方法是鑒別和檢測食品中過敏成分所必需的。該文綜述了基于蛋白質(zhì)和

7、脫氧核糖核酸(DNA)的食品過敏原檢測技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展，并展望了其未來發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞：食品過敏原；蛋白質(zhì)；脫氧核糖核酸；檢測中圖分類號(hào)：TS207.3文章編號(hào)：02545071（2017）07015704doi:10.11882j.issn.02545071.2017.07.034RecentadvanceofdetectiontechnologyoffoodallergensbasedonproteinDNADINGLiangFUL

8、inWUXiulianLIMengxue(GaochunTestingInstituteofQualityMetrologyNanjingBureauofQualityTechnicalSupervisionNanjing211300China)Abstract：Atpresentfoodallergieshavebecomeglobalhealthconcern.Thefoodallergenicingredientsmicroall

9、ergensproducedduringfoodprocessingwereahugehealththreatonsensitiveindividuals.Therefethereliableanalyticalmethodsarenecessarytoidentifydetectallergenicingredientsinfood.Theapplicationdevelopmentoffoodallergendetectiontec

10、hnologybasedonproteindeoxyribonucleicacid(DNA)weresummarizedthefuturedevelopmenttrendwasprospected.Keywds：foodallergensproteindeoxyribonucleicaciddetection收稿日期：20170510作者簡介：丁亮（1988），男，助理工程師，本科，研究方向?yàn)槭称窓z測。經(jīng)驗(yàn)交流157中國釀造2017年第

11、36卷第7期總第305期杏仁中Prudu5（也叫酸性核糖體蛋白P2）過敏原的編碼序列從其相關(guān)產(chǎn)品中鑒別杏仁。INIESTOE等[18]研究了烘焙、高壓和蒸汽滅菌處理對(duì)榛子過敏原編碼序列的影響，結(jié)果表明，熱處理、烘焙、蒸汽滅菌都可降低榛子DNA檢測能力，這是由于DNA提取率和DNA完整性降低。由于某些食品的組成成分可能抑制PCR反應(yīng)，其會(huì)影響qPCR對(duì)過敏成分的定量檢測[19]。在DNA提取和純化之前向食品中加入內(nèi)標(biāo)物將有助于提高定量結(jié)果

12、的可信度，因?yàn)槭称烦煞謱?duì)DNA提取和純化的影響可通過對(duì)內(nèi)標(biāo)物的影響估量。3.3高分辨熔解分析高分辨率熔解度分析（highresolutionmeltinganalysis，HRM）是通過檢測溫度升高時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸熔解產(chǎn)生的熒光變化，分析樣品中DNA產(chǎn)物[20]。隨著高分辨率儀器和飽和熒光DNA結(jié)合染料的發(fā)展，HRM分析已被用于基因分型、表觀遺傳學(xué)、食品檢測研究。因特定PCR產(chǎn)物的熔融溫度（Tm）可用于在種屬水平區(qū)分食品，HRM分析

13、已被用于食品成分鑒定。COSTAJ等[21]利用HRM結(jié)合實(shí)時(shí)PCR通過檢測杏仁中的Prudu5過敏蛋白編碼基因從加工食品中檢測到微量杏仁。MART魱NFERN魣NDEZB等[22]利用HRM可將小麥與其他谷物（如大麥、黑麥和燕麥）區(qū)分開。加工食品產(chǎn)物中榛子也可被DNA條形碼HRM定量，檢測限達(dá)0.01%[23]。3.4連接依賴探針擴(kuò)增連接依賴探針擴(kuò)增（ligationdependentprobeamplification，LPA）是基

14、于兩個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段探針，與靶序列DNA進(jìn)行雜交，然后連接擴(kuò)增，分析產(chǎn)物。僅當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸探針分別與靶序列完全互補(bǔ)時(shí)，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈，隨后產(chǎn)生特定大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過毛細(xì)管電泳鑒別[24]。LPA已用于檢測10種不同的過敏成分[25]。在不同的矩陣測試時(shí)，LPA可鑒別單一過敏原，檢測限達(dá)5mgkg。與內(nèi)部陽性對(duì)照信號(hào)相比，8種過敏成分信號(hào)的檢測限范圍為5～400基因拷貝數(shù)[26]。3.5DNAarr

15、ays為進(jìn)行多重檢測，許多芯片被用于檢測PCR產(chǎn)品，并用于檢測食品中的過敏成分。ROSSIS等[27]使用肽核酸（peptidenucleicacids，PNAs）芯片檢測擴(kuò)增的花生和榛子DNA。PNAs是結(jié)合到互補(bǔ)DNA序列的寡核苷酸類似物，較其同源DNA表現(xiàn)出更高的親和力和特異性[28]。電化學(xué)DNA芯片可檢測榛子中兩個(gè)不同過敏原的特異性DNA片段，且樣品濃度可在納摩爾水平。WANGW等[29]在含硅的表面開發(fā)出一種光學(xué)薄膜微陣列方

16、法，可在兩個(gè)tetraplexPCR系統(tǒng)中同時(shí)檢測8種食物過敏成分，如同時(shí)檢測腰果、花生、小麥、大豆、魚、雞、蝦和牛肉，及同時(shí)檢測芝麻、燕麥、杏仁、芹菜、榛子、核桃、羽扇豆和芥末[30]。此時(shí)，信號(hào)可肉眼觀察而不需額外的儀器。從榛子、花生和大豆DNA擴(kuò)增的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，可利用5′生物素探針雜交檢測，該探針可被鏈霉親和素修飾的數(shù)字化視頻光盤（digitalvideodisk，DVD）表面固定，檢測限達(dá)1μgg[31]?；?′S

17、H和3′生物素標(biāo)記莖環(huán)雙探針的電化學(xué)DNA傳感器，也可通過檢測Arah1基因的片段來檢測花生是否存在，檢測限為0.35fmolL，線性響應(yīng)范圍1015～1010molL。DNA傳感器可在未進(jìn)行PCR擴(kuò)增的情況下定量檢測花生乳飲料的DNA提取物[32]。4結(jié)束語如今，為了保護(hù)過敏機(jī)體免受過敏原反應(yīng)的困擾，人們提倡減少接觸任何過敏原的機(jī)會(huì)。但由于加工食品通常還有各種各樣的成分，包括潛在的過敏原，使得很難完全不接觸過敏原。因此，食品過敏原的檢

18、測是當(dāng)前食品安全的重要任務(wù)。由于依賴蛋白質(zhì)檢測方法的復(fù)用能力及質(zhì)譜儀器的新發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)方法正被廣泛替代傳統(tǒng)的免疫化學(xué)方法和基于DNA的PCR法。同樣的，多種DNA檢測新技術(shù)正蓬勃發(fā)展，如HRM、LPA和DNA芯片。除上述幾種方法外，寡合苷酸適體，即結(jié)合多種目標(biāo)物的單鏈或RNA寡核苷酸，也逐步作為抗體的另一選擇應(yīng)用于生物分析，目前已有多種適體用于食品過敏原的檢測；生物傳感器，特別是新型納米材料，也逐步用于檢測食品過敏原。在食品中的過敏

19、成分檢測中，為得到可靠的具有可比性的分析結(jié)果，還需要驗(yàn)證及協(xié)調(diào)各分析方法。同樣地，對(duì)于新開發(fā)的快速檢測方法，如基于生物傳感器的方法，也需要進(jìn)行驗(yàn)證，及評(píng)估其真實(shí)食品樣品中的適用性。參考文獻(xiàn)：[1]TOSCAMASILVESTRIMOLCESERetal.AllergenspecificIgEtofoodmolecularcomponentsage:Fromearlychildhoodtoadulthood[J].AllergolImmu

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