豬肉三聚磷酸酶調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)凝膠特性的研究.pdf

1、多聚磷酸鹽是肉制品加工中常用的添加劑，它們可以改變肌肉的離子強(qiáng)度和pH，可以與蛋白的相互作用，解離肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物，增加蛋白質(zhì)表面的凈電荷數(shù)，改善肉或肉制品的保水性、嫩度和適口性．然而添加到肉中的多聚磷酸鹽會(huì)在肉中多聚磷酸酶的作用下不斷水解，其中焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽主要通過焦磷酸酶( PPase)和三聚磷酸酶（TPPasc）降解。本研究以豬背最長肌為實(shí)驗(yàn)材料，首先，分離純化PPase和TPPase并其酶學(xué)特性進(jìn)行研究。其次，利用免試劑離

2、子色譜技術(shù)觀測焦磷酸鈉( TSPP)、三聚磷酸鈉（STPP）及其復(fù)合物在純化后PPase或/和TPPase的作用下多聚磷酸鹽的量變和分子形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化．最后，研究TSPP，STPP和磷酸鹽混合物在不同水解時(shí)段對肌肉勻漿物溶解性、流變特性和凝膠特性的影響。具體研究結(jié)果如下：
　　 1焦磷酸酶的分離純化與酶學(xué)特性研究
　　 通過超速離心，硫酸銨分級(jí)沉淀和陰離子交換層析，從豬背最長肌中分離純化出PPase．PPase在非變性電

3、泳和變性電泳圖譜上均呈現(xiàn)單一蛋白條帶．PPase活性為0.43lunol-mg-1 protein·min-1，純化倍數(shù)30.7，酶活回收率8％。PPase的底物專一性很強(qiáng)．但在反應(yīng)體系內(nèi)底物( TSPP)濃度超過3 mmolL-1時(shí)，將會(huì)抑制PPase的活性．PPase最適反應(yīng)溫度和pH值分別為50℃和7.5。Mg2+是PPase必需金屬離子，在4.75 mmol.L-1濃度時(shí)，對酶激活作用最強(qiáng)。Ca2-卻抑制酶的活性，NaCI和KC

4、I均會(huì)抑制酶的活性，NaCl的抑制效應(yīng)強(qiáng)于KC1．EDTA-Na2和EDTA-Na4在高濃度時(shí)對酶活有較強(qiáng)的抑制作用。1mmol.L-1NaF可以完全抑制酶的活性。PPase水解TSPP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為0.36mmol-L-1PP,Vmax為0.086μmolPi·mg-1 protein·min-1.
　　 2三聚磷酸酶的分離純化與酶學(xué)特性研究
　　 通過超速離心、分級(jí)沉淀和DEAE-52交換層析，從豬背最長肌中分離

5、純化出TPPase．證實(shí)三聚磷酸酶是肌球蛋白。TPPase純化倍數(shù)4.12，回收率5.65%。TPPase的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為40℃和6.0，Mg2+、Ca2+對TPPase均有激活作用，分別在0.5 mmolL-1和2.0 mmol.L-l濃度時(shí)使酶活達(dá)到最大．PP是TPPase的競爭性抑制劑，PP添加濃度達(dá)到4 mmol·L-1時(shí)，相對酶活僅剩7.88%．鹽離子NaCl和KCl對純化后肌球蛋白TPPase均有抑制作用，KC1

6、的抑制效應(yīng)強(qiáng)于NaCl．EDTA-Na2和KI03對酶活均有抑制作用，Mg2+可以解除EDTA-Na2的抑制效用．TPPase水解TPP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax為0.049 grnol Pi·mg-1 protein·min-1,Km為0.37 mmol·L-1TPP.
　　 3多聚磷酸鹽在純化酶系統(tǒng)中水解的定量分析
　　 利用免試劑離子色譜法測定多聚磷酸鹽在純化酶系統(tǒng)中水解變化。PP在PPase的作用下直接被水解成正磷酸鹽

7、(Pi)50min水解完畢。STPP水解分為兩步，首先被水解PP和Pi，其次生成的PP被進(jìn)一步水解成Pi。STPP在單一STPPase作用下水解非常緩慢，30 h僅有0.0376g·L-1STPP被水解，派生的TSPP的量一直在增加。而在PPase和STPPase共同作用下，水解過程中派生的TSPP會(huì)被迅速水解，沒有任何積累，STP．P在30h可以完全水解。在TPPase作用下STPP和TSPP共存時(shí)，STPP水解更加緩慢，30h僅有0

8、.0111g.L-1STPP被水解，TSPP在此水解期間不僅沒有下降還上升了0.0065 g·L-1.Pase和PPase共同作用于STPP、TSPP和HMP的混合物時(shí)( TSPP/STPP/HMP=1：1：1)，STPP水解速率慢于TPPase和PPase共同作用于STPP時(shí)。HMP水解比較緩慢，30 h還有大量未水解。研究證實(shí)肌球蛋白幾乎沒有焦磷酸酶活性，多聚磷酸鹽以混合形式添加時(shí)其各組分總體水解速率會(huì)變慢，主要原因是TSPP會(huì)抑制

9、STPP水解。
　　 4多聚磷酸鹽水解對豬肉勻漿物流變特性和凝膠特性的影響
　　 TSPP、STPP、磷酸鹽混合物A(TSPP/STPP/HMP=2:5:2)和磷酸鹽混合物B( TSPP/STPP/HMP=5:2:2)的添加可以提高肌肉勻漿物蛋白質(zhì)溶解度，降低蛋白濁度．多聚磷酸鹽的添加可以有效提高肌肉蛋白凝膠過程中最終貯能模量G值。多聚磷酸酶抑制劑EDTA-Na2的添加能延緩TSPP和STPP的水解，從而提高肌肉蛋白質(zhì)凝