油藏烷烴單加氧酶基因(alkB)的多樣性和定量研究.pdf

1、目前，油藏環(huán)境中的微生物分子生態(tài)學(xué)研究主要集中于群落結(jié)構(gòu)的多樣性，而對(duì)于微生物的功能結(jié)構(gòu)及功能多樣性與環(huán)境因素之間相關(guān)性的研究較少。環(huán)境中微生物群落功能多樣性的檢測(cè)依賴(lài)于功能基因多樣性的檢測(cè)，了解油藏微生物功能的多樣性及其影響因素，對(duì)于研究?jī)?nèi)源微生物采油機(jī)理有很大促進(jìn)作用。
　　 本文構(gòu)建了一種接頭特異引物多重PCR(JSPs-Multiplex-PCR)方法，通過(guò)克隆文庫(kù)和Q-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多基因（尤其是同工酶基因）的精確多

2、樣性和定量分析，并用該方法對(duì)油藏烷烴單加氧酶基因（alkB）進(jìn)行了檢測(cè)。利用設(shè)計(jì)出兩對(duì)接頭引物(Joint Primer，JPs)。分別針對(duì)非同源基因和同源基因設(shè)計(jì)特異引物，并在引物5'端加上接頭序列，得到一系列的接頭特異引物(Joint Special Primers，JSPs)。基本原理是:先用JSPs引物預(yù)擴(kuò)增靶基因，若干循環(huán)后得到兩端具有接頭序列的產(chǎn)物，然后再利用JPs引物進(jìn)行擴(kuò)增。將這種方法運(yùn)用到實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，并與

3、多重PCR技術(shù)和簡(jiǎn)并PCR技術(shù)的進(jìn)行比較。結(jié)果表明:與多重PCR技術(shù)相比，JSPs多重PCR技術(shù)能顯著降低引物之間的干擾和擴(kuò)增效率差異;上下游JPs引物都為JP2-F引物時(shí)，定量PCR能避免引物二聚體的干擾，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍為102～108copies/μL;與簡(jiǎn)并PCR技術(shù)相比，JSPs多重Q-PCR技術(shù)擴(kuò)增效率更接近1，線(xiàn)性范圍更廣，定量結(jié)果更準(zhǔn)確。將JSPs多重PCR技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境樣品alkB的檢測(cè)之中。采用該技術(shù)與簡(jiǎn)并PCR技

4、術(shù)分別對(duì)單菌和環(huán)境樣品中alkB進(jìn)行檢測(cè)，并構(gòu)建alkB克隆文庫(kù)。結(jié)果表明:JSPs多重PCR技術(shù)能檢測(cè)出更多的alkB，擴(kuò)增效率更高，非特異性擴(kuò)增更少，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際更相符。進(jìn)一步利用該技術(shù)監(jiān)測(cè)采油過(guò)程中alkB的多樣性和豐度變化，分析其與驅(qū)油效果和環(huán)境因素之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:各井a(chǎn)lkB濃度增加與增油效果相吻合;外源營(yíng)養(yǎng)注入后，alkB的多樣性和濃度均有提高，但alkB與16S rRNA基因的比值降低，說(shuō)明豐富營(yíng)養(yǎng)不利于提高烴氧