二苯并噻吩單加氧酶DszC和二苯并噻吩砜單加氧酶DszA的蛋白晶體學(xué)結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、白僵菌被廣泛地開發(fā)成不同形式的真菌殺蟲劑，在農(nóng)林害蟲的防治中，經(jīng)濟和生態(tài)效益顯著。然而，由于缺乏有效的形態(tài)學(xué)分類特征，白僵菌種難以準確鑒定，嚴重阻礙了該屬種和菌株的多樣性的評估。目前，基因系譜手段和許多分子標記已經(jīng)被用于白僵菌的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳多樣性的研究中，使得該類群的分子鑒定和遺傳多樣性研究得到了長足的發(fā)展。本論文就是利用基因系譜學(xué)對中國白僵菌分子系統(tǒng)學(xué)進行初步研究，同時還利用SSR分子標記對兩種不同森林生態(tài)系中的球孢白僵菌的

2、遺傳多樣性和寄主轉(zhuǎn)移進行了研究，綜合比較了這兩種森林生態(tài)系統(tǒng)中球孢白僵菌的遺傳結(jié)構(gòu)特點。
　　 本研究首次建立多位點PCR-DGGE技術(shù)，并將該技術(shù)用于球孢白僵菌基因分型研究。利用三個基因位點的DGGE電泳分析手段對17株球孢白僵菌進行基因分型，三個基因位點EF1-α、Bloc和ITS的DGGE電泳可以將17個菌株分別分成10、12、5個基因型，最后通過三個位點綜合分析將這17個菌株分成13個多位點基因型。分析結(jié)果揭示出該方法是

3、一個分辨能力較強和很有潛力的基因型分型和菌株鑒定分子工具。在隨后的球孢白僵系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究時，也證實多位點的DGGE電泳可以掃描大量球孢白僵菌菌株，減少研究的時間和隨后的測序費用。
　　 在中國廣義球孢白僵菌分子分類研究中，通過ITS和EF1-α兩個基因位點的DGGE電泳初步確定了205株來自中國不同地理區(qū)域的廣義球孢白僵菌為18種基因型。測定了這18個菌株的ITS和EF1-α全序列。系統(tǒng)發(fā)育分析表明：這18個菌株和GenBan

4、k上的18個菌株可劃分4個分支。Ⅰ分支為狹義球孢白僵菌，Ⅱ分支為布氏白僵菌，Ⅲ分支為假球孢白僵菌，Ⅳ分支為蟲草的一種白僵菌無性型。在狹義球孢白僵菌分支中又可劃分為7個亞分支，有4個亞分支中含來自中國的菌株?？傮w上看，中國廣義球孢白僵菌含有兩個種，一是狹義球孢白僵菌，且絕大多數(shù)的研究菌株都屬于此類群；二是假球孢白僵菌，僅有14株，所占比例很低，這是在中國的首次發(fā)現(xiàn)。在狹義球孢白僵菌中，A和C亞分支為亞洲的2個獨特類群，歐洲有3個特殊的亞分

5、支，其他兩個亞分支包含了兩個大洲的菌株。這也在一定程度上反映了菌株遺傳特性和地理來源有一定的相關(guān)性，這可能是由于地域的隔離造成的結(jié)果。
　　 在鑒定來自山西古交的寄主大部分是紅脂大小蠹的12株病原菌中，有10株經(jīng)過DGGE電泳、并結(jié)合形態(tài)特征和ITS序列測定，鑒定為假球孢白僵菌。這10個菌株的菌落背面全部呈現(xiàn)紅色到深紅色，而在中國其他地方發(fā)現(xiàn)的假球孢白僵菌菌落背面是白色至淡黃色，通過ITS序列比較兩者之間無堿基差異。
　　

6、 利用ITS-DGGE對RCEF菌種庫中的布氏白僵進行初步電泳分型，結(jié)果顯示71株布氏白僵菌分成8種帶型。8種帶型的ITS序列在線Blast比對發(fā)現(xiàn)：這些原先被鑒定為布氏白僵菌的菌株中多數(shù)不是布氏白僵菌，其中有12株的ITS序列和布氏白僵菌相似率為100％。這12株布氏白僵菌包含在4種基因型中，其中B基因型有9個菌株，通過形態(tài)學(xué)特征研和分子數(shù)據(jù)，將這12株確定為布氏白僵菌：結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列，將5個A帶型菌株鑒定為假球孢白僵菌

7、；屬于G帶型以及與G帶型類似的共有51株，G帶型代表菌株RCEF1697序列在NCBI上比對發(fā)現(xiàn)和狹義球孢白僵菌相似率為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將這種帶型或者類似帶型的菌株鑒定為球孢白僵菌；C帶型的菌株RCEF4715序列與GenBank登錄的一株蟲草的白僵菌無性型相差6個堿基，相似率為99%，結(jié)合形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)將C帶型鑒定為“E”分支的種；屬于H帶型的RCEF3903菌株ITS序列與最接近的馬拉維白僵菌Beauveriamalaw

8、iensis序列相似率為98%，根據(jù)其在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置，加上其獨特的形態(tài)特征，確認該菌株是白僵菌屬的一個新種，命名為中國白僵菌Beauveriasinensis。
　　 利用SSR分子標記對麻姑山球孢白僵菌遺傳多樣性進行研究，并探討了寄主轉(zhuǎn)移問題。通過SSR電泳，102株球孢白僵菌分成31個多位點微衛(wèi)星基因型。按時間和寄主劃分群體研究這些菌株的遺傳分化指數(shù)均表明種群內(nèi)的遺傳變異主要來源于居群內(nèi)部，并且種群內(nèi)的遺傳分化系數(shù)Gs

9、t達到了高度分化水平。麻姑山球孢白僵菌的Nei's基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)分別為0.1987和0.2789。在該地區(qū)的5種主要微衛(wèi)星基因型中，基因型XC1可以通過不同寄主完成在全年采集月份的延續(xù)，這表明，球孢白僵菌在自然環(huán)境中隨著寄主的種類改變而不斷改變其寄生目標，即通過寄主轉(zhuǎn)移完成此類基因型株系在森林生態(tài)系中的傳播和繁殖。其他基因型基本上可以完成在2到3個月的延續(xù)。同時發(fā)現(xiàn)，同一基因型菌株可以侵染不同的寄主昆

10、蟲，而相同寄主也可以被不同基因型菌株侵染，因此該地區(qū)的球孢白僵菌不僅在種水平而且在菌株水平上寄主?；暂^低。
　　 在對瑯琊山地區(qū)378株球孢白僵的遺傳多樣性和寄主轉(zhuǎn)移的研究中，發(fā)現(xiàn)SSR電泳將這些菌株分成145個多位點微衛(wèi)星基因型；按照寄主和季節(jié)劃分居群研究這378株球孢白僵菌的基因分化系數(shù)Gst分別為0.1815和0.1964，都達到了高度分化水平，基因流(Nm)分別為1.1208和1.100；瑯琊山球孢白僵菌總的Nei's

11、基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)分別為0.2101和0.3299。綜合分析表明，瑯琊山地區(qū)的球孢白僵菌種群內(nèi)的遺傳變異也是來源于居群內(nèi)。比較發(fā)現(xiàn)，瑯琊山地區(qū)這種天然次生林中的球孢白僵菌種群內(nèi)的遺傳多樣性明顯高于宣城的麻姑山人工馬尾松林。
　　 在這7個相對優(yōu)勢的基因型中，LYS14基因型通過轉(zhuǎn)寄主幾乎完成了其在一整年內(nèi)的延續(xù)，而其他基因型基本上都可以延續(xù)4-7個月的時間。LYS8基因型寄主為斑衣蠟蟬占有該基因型