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文檔簡介
1、石油作為人類的重要能源正在不斷減少。在開發(fā)和利用石油的過程中，環(huán)境也不可避免的遭到了破壞。研究新的采油技術和石油污染修復技術將會很好的解決上述問題。
Geobacillus thermodenitrificans NG80-2分離子天津大港油田。通過前期基因組學和蛋白質組學的研究，發(fā)現(xiàn)NG80-2存在一條降解長鏈烷烴途徑，ladA是這條途徑中最重要的一個基因，它參與NG80-2降解長鏈烷烴的第一步反應，能把直鏈飽和烷烴(C
2、15～C36)氧化為相應的伯醇。LadA嗜熱，可溶，是單一組分酶，易于在E.coli中表達和純化。這些優(yōu)良性狀使得LadA在工業(yè)合成、石油開采和石油環(huán)境污染等領域有很大的潛力。
本實驗在前期實驗的基礎上通過定點突變、融合蛋白等分子生物學方法改造了LadA酶分子，構建了6個LadA突變克隆，5個LadA與輔酶依賴NADH的FMN還原酶克隆(區(qū)別在于ladA和其輔酶基因的鏈接臂密碼子不同)，對這11個克隆進行了E.coli中表
3、達條件的優(yōu)化，最終純化出兩個LadA改造蛋白：F146C突變蛋白和一個LadA/依賴NADH的FMN還原酶融合蛋白，其他9個改造蛋白均以包涵體形式存在，需要進一步對其進行優(yōu)化。構建了9個LadA突變酶在Pseudomonas fluorescens KOB2△1(一株缺失菌)的互補菌株。通過在C16中的培養(yǎng)9個互補菌株(LadA互補菌株為參考菌株；不加碳源C16培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株為負對照)和測定生長曲線，體內驗證了這9個LadA突變活性，
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