來(lái)源于蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中產(chǎn)抑菌素乳酸菌的分離、鑒定、特性研究.pdf

1、乳酸菌可以產(chǎn)生各類抑菌物質(zhì)，如酸類物質(zhì)乳酸和乙酸、過(guò)氧化氫、抑菌素等。抑菌素是一類由乳酸菌分泌產(chǎn)生有抑菌作用的蛋白類物質(zhì)。來(lái)源于乳酸菌的抑菌素可作為生物防腐劑應(yīng)用到食品中，因?yàn)槿樗峋ǔ１蛔鳛榘l(fā)酵食品的發(fā)酵劑，并且被認(rèn)為是對(duì)人安全的GRAS食品添加劑。抑菌素和抗生素最大的不同是抑菌素嚴(yán)格作用于相關(guān)的特定微生物或者是和產(chǎn)抑菌素菌類相近的微生物類群。另一方面，抗生素有更廣泛的抑菌譜，且對(duì)親緣關(guān)系近的菌株沒(méi)有選擇性。另外，抑菌素是核糖體合成的

2、初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物，而抗生素通常是初級(jí)代謝產(chǎn)物。對(duì)于蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中產(chǎn)抑菌素乳酸菌的研究還很少。因此，本研究的目的是從蒙古不同地區(qū)的發(fā)酵乳制品中分離篩選出產(chǎn)抑菌素的乳酸菌，研究不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)抑菌素效果的影響，優(yōu)化培養(yǎng)條件，評(píng)價(jià)抑菌素對(duì)食品腐敗菌Listeria monocytogenes和Enterococcus faecalis的抑制作用。在研究中，對(duì)乳酸菌的初篩使用含有5％(w/v)CaCO3和0.02%(w/v)溴甲酚紫的改

3、良MRS培養(yǎng)基，對(duì)乳酸菌的鑒定采用16 S rRNA基因序列分析的方法，并使用牛津杯法抑菌試驗(yàn)篩選抑菌素生成菌株及測(cè)定抑菌素活力。通過(guò)pH、溫度和酶的作用等因素對(duì)抑菌素活力的影響研究抑菌素的特性。研究在極端條件下，如低pH、高膽鹽等的耐受程度，產(chǎn)抑菌素活力的變化情況來(lái)表明其作為益生菌的特性。使用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化產(chǎn)抑菌素條件，確定對(duì)產(chǎn)抑菌素最重要的影響因素，通過(guò)響應(yīng)面分析建立模型，評(píng)價(jià)主要的影響因子，確定有顯著

4、性的影響因子，選擇出產(chǎn)抑菌素的最優(yōu)條件。本研究的主要結(jié)果如下所示：
　　1、來(lái)源于蒙古傳統(tǒng)乳制品中產(chǎn)抑菌素乳酸菌的分離、篩選與鑒定
　　使用含有5%(w/v) CaCO3和0.02%(w/v)溴甲酚紫的改良MRS培養(yǎng)基對(duì)來(lái)自蒙古傳統(tǒng)乳制品的10種樣品進(jìn)行乳酸菌的分離，通過(guò)培養(yǎng)基顏色改變、過(guò)氧化氫酶作用和溶鈣圈的形成，確定其中六種樣品含有乳酸菌。從六種樣品中，挑選、純化出125株革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性菌株。觀察單菌株的形態(tài)

5、特征，大部分菌株球菌（8株分離自MG2，9株分離自MG6，13株分離MG7，48株分離自MG8，40株分離自MG9，4株分離自MG10），剩下的是桿菌（3株分離自MG6.1）。因此，使用這125株菌進(jìn)行抑菌素的初篩。結(jié)果表明，30株菌具有抑制E.faeacalis VTM2R和L. monocytogenes ATCC19114的活性。同時(shí)測(cè)定了菌株的無(wú)細(xì)胞上清液的抑菌效果。在30株菌中，只有MG2-8、MG6-1和MG10-2的無(wú)細(xì)胞

6、上清液表現(xiàn)出對(duì)E.faecalis VTM2R和L. monocytogenes ATCC19114的抑制作用。通過(guò)16S rRNA序列分析鑒定這三株菌為Enterococcus durans(MG2-8)，Enterococcus faecium(MG6-1),和Enterococcus durans(MG10-2)。MG2-8的無(wú)細(xì)胞上清液表現(xiàn)出對(duì)E. faecalis和L. monocytogenes最高的抑菌效果，因而選擇Ent

7、erococcus durans MG2-8，進(jìn)一步研究其產(chǎn)抑菌素的特性，并優(yōu)化其產(chǎn)抑菌素的培養(yǎng)條件。指示菌E.faeacalis VTM2R和L.monocytogenes ATCC19114屬抑菌素敏感菌株。因此，在這項(xiàng)研究中選擇這兩株菌作為指示菌。在研究中還測(cè)定了E.durans MG2-8生長(zhǎng)及產(chǎn)抑菌素情況，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)3h后，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，細(xì)胞密度從0.3增長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期末的1.44。在培養(yǎng)2h后當(dāng)抑菌素活力為60 AU/ml，

8、表現(xiàn)出對(duì)E.faecalis VTM2R的抑制作用，當(dāng)培養(yǎng)到30h，在穩(wěn)定期內(nèi)，抑菌素的活力達(dá)到最大值為480 AU/ml。
　　2、產(chǎn)抑菌素菌株Enterococcus durans MG2-8的抑菌素特性及益生菌特性
　　酶類對(duì)MG2-8產(chǎn)抑菌素的影響作用顯示，當(dāng)加入蛋白分解酶如蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白時(shí)，抑菌效果明顯減弱，而使用非蛋白分解酶如纖維素酶、溶壁酶作用時(shí)，不影響抑菌效果，這表明MG2-8的抑菌作用是因?yàn)槠洚a(chǎn)

9、生的蛋白類物質(zhì)。無(wú)細(xì)胞上清液（活力為60 AU/ml）在100℃120 min條件，抑菌活力沒(méi)有明顯損失，然而121℃5 min則抑菌活力完全失去。對(duì)抑菌素對(duì)產(chǎn)生菌細(xì)胞的吸附的研究表明，該抑菌素對(duì)產(chǎn)生菌的細(xì)胞沒(méi)有吸附作用。100 AU/ml活力的抑菌素對(duì)培養(yǎng)2 h的指示菌抑制結(jié)果表明，在前10 h能完全抑制指示菌的長(zhǎng)，L.monocytogenes ATCC9114和E. faecalis VTM2R兩種菌液濃度僅各自分別從0.07到0

10、.08和0.12到0.19(OD600)，到14 h時(shí)指示菌開(kāi)始快速增長(zhǎng)，22 h達(dá)到對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌素MG2-8通過(guò)Tricine-SDS-PAGE測(cè)定分子量，染色的一半膠中觀察到有兩條蛋白質(zhì)條帶，對(duì)照另一半覆蓋有糞腸球菌VTM2R的BSM軟瓊脂的膠的抑菌圈的位置，可知細(xì)菌素MG2-8的分子量大約為5.8kDa，通過(guò)分子量的大小確定了細(xì)菌素MG2-8屬于II類細(xì)菌素。培養(yǎng)條件中NaCl、pH和膽鹽濃度對(duì)E. durans MG2-8生

11、長(zhǎng)的影響表明，該菌可以在9%NaCl的條件下生長(zhǎng)，對(duì)膽鹽耐受性的濃度為0.3%，對(duì)pH的耐受范圍在2-12之間。
　　3、MG2-8產(chǎn)抑菌素條件優(yōu)化
　　Plackett-Burman design試驗(yàn)結(jié)果表明在經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)后24種影響因子下的抑菌素活力在60~960 AU/ml的范圍內(nèi)。通過(guò)顯著性分析，胰蛋白胨、脫脂奶粉和葡萄糖的置信度分別達(dá)到95.9%、99.4%和99.6%（p-值<0.05)。然后通過(guò)響應(yīng)面分析法

12、確定顯著的影響因子進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用中心合成設(shè)計(jì)（CCD）的結(jié)果表明，在20種設(shè)計(jì)中抑菌素的活力在360~960AU/ml的范圍內(nèi)。該模型計(jì)算的樣本可決系數(shù)R2為0.84，這和修正決定系數(shù)值很接近，說(shuō)明得到的二次模型方程有較高的擬合度。響應(yīng)面分析得到的優(yōu)化結(jié)果和二次模型方程預(yù)測(cè)的結(jié)果很接近。最佳的產(chǎn)抑菌素的條件為胰蛋白胨17.93(g/l)、脫脂奶粉2.06(g/l)和葡萄糖10.62(g/l)，響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的產(chǎn)抑菌素活力為972.78

13、AU/ml。通過(guò)進(jìn)一步的重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)得到該條件下的產(chǎn)抑菌素活力為960 AU/ml和預(yù)測(cè)的結(jié)果較為一致。通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)抑菌素菌株培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，產(chǎn)抑菌素活力從480 AU/ml增長(zhǎng)到960 AU/ml。上述實(shí)驗(yàn)表明，可以通過(guò)Plackett-Burman design和響應(yīng)面分析法（RSM）在對(duì)Enterococcus durans MG2-8產(chǎn)抑菌素的培養(yǎng)基成分的優(yōu)化以提高產(chǎn)抑菌素活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也確認(rèn)了該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析的可信度