酸性多糖甲基化分析方法的改進.pdf

1、酸性多糖中羧基和硫酸根等酸性基團的存在,影響了其在甲基化溶劑中的溶解,致使甲基化程度往往較低,且糖醛酸中羧基的存在導致酸性多糖不易氣化和水解,限制了其應用氣相-質(zhì)譜連用(GC-MS)進行結(jié)構分析,制約了甲基化方法在酸性多糖中的應用。本文對甲基化分析過程中出現(xiàn)的酸性多糖不易在甲基化試劑中溶解和硫酸根位置不易確定等問題進行了研究,以含有糖醛酸和硫酸根的酸性多糖標準品硫酸軟骨素(CS)為原料,對含有糖醛酸的酸性多糖還原的條件進行優(yōu)化,確定最佳

2、的糖醛酸還原條件;對含有硫酸根的酸性多糖的脫硫方法和其在甲基化試劑中的溶解性等問題進行了探討,對比研究確定最佳的酸性多糖甲基化條件,為酸性多糖的結(jié)構分析奠定基礎。
　　首先以 CS為研究對象,對糖醛酸羧基還原的方法進行改良。比較了鈉型和氫型 CS樣品分別在不同緩沖液體系、控制pH值的條件下,還原率的高低。結(jié)果顯示,氫型 CS在改良后的75％四氫呋喃-0.1 mol/L2-嗎啉乙磺酸(THF-MES)的緩沖液中,pH4.75和50℃

3、的條件下,采用碳二亞胺-硼氫化鈉(EDC-NaBH4)法還原,糖醛酸還原率高達98%以上,明顯高于鈉型。比較了不同檢測方法測定糖醛酸還原率的優(yōu)劣,結(jié)果顯示高效液相色譜(HPLC)法快捷方便,結(jié)果準確,是一種理想的糖醛酸還原率檢測方法。將該方法應用于不同結(jié)構的酸性多糖糖醛酸還原中,表明該方法具有普適性,不僅適用于CS類,同樣適應于透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid)和肝素(Heparin)中糖醛酸還原,也適用于海洋來源的聚甘露糖醛酸

4、(Polymannuronic Acid)及褐藻糖膠(Fucoidan)中糖醛酸的還原,為不同酸性多糖結(jié)構分析,尤其甲基化分析中確定多糖連接方式提供了前提。
　　對酸性多糖甲基化分析中樣品溶解性差和脫硫不完全等問題進行探討。通過將含硫酸根的 CS與不同堿成鹽進行甲基化,發(fā)現(xiàn)將 CS與三乙胺成鹽能極大提高其在甲基化試劑中的溶解、提高甲基化產(chǎn)率,全甲基化產(chǎn)率可達40%。通過比較CS通過PMA法和甲醇-DMSO法進行脫硫,發(fā)現(xiàn)采用PMA

5、法脫硫后硫酸根含量低、分子降解程度較低,是一種比較理想的脫硫方法。通過將CS及其他酸性多糖經(jīng)過糖醛酸還原和 PMA脫硫以后,GC- MS結(jié)果顯示樣品離子響應明顯提高,說明此方法適于含有糖醛酸和硫酸根酸性基團的酸性多糖甲基化,利于進一步的結(jié)構研究。且首次發(fā)現(xiàn)多硫酸根樣品甲基化后全甲基化樣品會較多溶于水層,對水層與氯仿層樣品同時進行GC-MS對比分析,可得到較準確的結(jié)構信息。
　　本文利用所建立的方法,通過對不同結(jié)構的含有糖醛酸的酸性