AXIN2基因在肝細胞癌中的表達及甲基化分析.pdf

1、背景和目的：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在我國,每年約有300,000人死于HCC,約占全世界HCC年死亡總數(shù)的50％。HCC的發(fā)生是一個涉及多基因改變的復雜過程,已有研究證實,在HCC發(fā)生過程中存在著多種抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的高甲基化現(xiàn)象,干擾抑癌基因的轉(zhuǎn)錄,導致細胞異常增殖,引起細胞癌變。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路的異常激活與包括HCC在內(nèi)

2、的多種腫瘤的形成相關(guān)。作為該途徑的負性調(diào)控因子,AXIN2基因在結(jié)腸癌,肺癌等惡性腫瘤中存在啟動子高甲基化所致表達缺失或下調(diào),最終導致Wnt/β-catenin信號通路異常激活并引起相應(yīng)腫瘤的發(fā)生,但在HCC中是否存在AXIN2基因啟動子甲基化異常尚不完全確定。本研究檢測了AXIN2基因在肝癌細胞系和HCC組織中mRNA表達情況及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),初步分析AXIN2基因甲基化水平對mRNA表達的影響,探討AXIN2基因異常甲基化在HC

3、C發(fā)生、發(fā)展中的意義。
　　 材料與方法：收集53例河南省腫瘤醫(yī)院2009年5月至2010年4月手術(shù)切除的HCC和相應(yīng)的癌旁(距離癌組織大于2cm)組織標本。所有患者均有肝硬化背景,多數(shù)(48/53)為乙肝病毒感染,其中男性48例,女性5例,年齡35～76歲,中位年齡52歲。參照2010巴塞羅那BCLC分期法:A期16例,B期4例,C期33例,D期0例。所有患者均簽署知情同意書,均為第1次手術(shù),術(shù)前均未實施化療和其他治療。正常對

4、照17例,為因肝海綿狀血管瘤手術(shù)切除的正常肝臟組織標本。所有標本均獲得病理證實。
　　 5株人肝癌細胞系HepG2、SMMC-7721、Skhep-1、Hep3B、PLC/PRF/5和1株正常肝細胞系L02,由北京大學醫(yī)學部病原生物學系微生物學教研室提供。
　　 用Trizol(Sigma公司)法提取組織細胞總RNA,分光光度計檢測抽提的質(zhì)量和濃度;再按照Fennentas逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書操作步驟合成cDNA。熒光定量R

5、T-PCR檢測AXIN2基因mRNA在細胞系和40例配對肝癌組織中的表達。提取組織細胞DNA,熒光定量PCR檢測細胞系和53例配對肝癌組織中AXIN2基因啟動子區(qū)甲基化水平。數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0進行Wilcoxon符號秩和檢驗、t檢驗、Fisher確切概率法和Spearman秩相關(guān)檢驗的統(tǒng)計學處理,以α=0.05為檢驗水準。
　　 結(jié)果：
　　 1.AXIN2 mRNA在40例HCC和配對癌旁組織中均有表達。AXIN2

6、基因在癌組織中的mRNA表達水平(0.1629±0.06791)低于癌旁組織(0.4155±0.23304),且具有統(tǒng)計學意義(Z=-2.567,P=0.010)。
　　 2.AXIN2基因在HepG2、SMMC.7721、Skhep-1、Hep3B、PLC/PRF/5等5種人肝癌細胞系中的甲基化水平分別為:98.15％、98.38％、96.00％、93.14％、83.27％,均明顯高于正常肝細胞系L02的甲基化水平7.38％。

7、
　　 3.53例HCC組織及配對癌旁組織的AXIN2基因甲基化水平均明顯高于正常組織(t=-3.663,P=0.009;t=4.591,P=0.007),HCC組織與配對癌旁組織之間甲基化水平無明顯差異。
　　 4.AXIN2 mRNA表達水平與甲基化狀態(tài)呈負相關(guān)(r=0.458,P=0.032);AXIN2基因高甲基化率低于AXIN2 mRNA低表達率。
　　 5.AXIN2基因在BCLC C期HCC患者中的