S100A8基因在原發(fā)性肝細胞癌中的甲基化檢測和功能研究.pdf

1、目的:研究S100A8基因特異性位點甲基化在人原發(fā)性肝細胞癌（HCC）中的表達情況，并在細胞水平、動物水平觀察S100A8對HCC增殖、遷移、侵襲及裸鼠成瘤能力的影響，從而為進一步了解S100A8對HCC細胞生物學行為的影響并為探討其作用機制、尋找HCC診斷及預后的新靶點奠定基礎。
　　方法:
　　1.利用公共數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus(GEO)及The CancerGenome Atlas，（TC

2、GA，https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）進行檢索，根據(jù)檢索詞及嚴格的數(shù)據(jù)納入、排除標準，進行薈萃分析。
　　2.采用TCGA數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)經(jīng)過嚴格篩選后將其甲基化程度分組后進行生存分析（Kaplan-Meier法）。
　　3.收集臨床樣本，利用焦磷酸測序技術驗證原發(fā)性肝細胞癌組織與其對應的癌旁組織中cg20070090位點的甲基化水平，并通過受試者工作特征曲線(ROCcurve)探索cg2

3、0070090位點在肝細胞癌診斷中的臨床價值。
　　4.構建S100A8慢病毒表達載體，通過人胚源腎細胞293T及慢病毒包裝系統(tǒng)合成病毒液，經(jīng)過病毒濃縮和滴度檢測，選取最適量病毒液侵染目的肝癌細胞Huh7、MHCC-97H（以下簡寫97H）和HepG2。
　　5.形成穩(wěn)定細胞系后，通過Realtime-qPCR、蛋白質免疫印跡(WB)分別檢測S100A8 mRNA與蛋白的表達。
　　6.細胞功能實驗，體外探討S100A

4、8對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響。
　　7.裸鼠皮下成瘤實驗，在體內研究S100A8對肝癌細胞致病的影響。
　　結果:
　　1.課題組兩名以上成員對公共數(shù)據(jù)庫(GEO、TCGA)的甲基化芯片數(shù)據(jù)進行檢索;嚴格按照納入、排除標準選取符合的研究;最終有5個數(shù)據(jù)集被納入本研究。薈萃分析結果提示，S100A8甲基化程度與HCC的發(fā)生率有關聯(lián)（SMD=-2.08，95％CI:-2.54--1.62）。發(fā)表偏倚分析中P＞0

5、.05，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚，結論可信度較高。并經(jīng)過敏感性分析剔除每個研究后，重復進行薈萃分析，結果并未發(fā)生改變，提示本次研究薈萃分析的結果具有高度穩(wěn)定性。
　　2.TCGA數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)經(jīng)過嚴格篩選后，最終選取了345名肝癌患者數(shù)據(jù)進行生存分析(Kaplan-Meier);結果顯示，在4組甲基化水平分組比較中，總生存期(OS)和無進展生存期（PFS）均有明顯的差異。低甲基化組(Q1)的OS和PFS明顯短于高甲基化組。
　　

6、3.焦磷酸測序部分，配對t檢驗結果顯示癌組織的平均甲基化水平為（32.93％±14.82％）;癌旁組織平均甲基化水平為(64.91％±4.65％);ROC曲線下面積(AUC)為0.950（P＜0.01），最佳截斷值為54.025％，敏感度為86.53％，特異性為98.07％。結果表明此實驗方法的結果準確性較高。
　　4.本研究成功包裝合成了S100A8過表達及沉默的慢病毒液;經(jīng)過慢病毒液的濃縮及滴度檢測，篩選出合適量的病毒液，并用

7、于侵染目的肝癌細胞株Huh7、MHCC-97H和HepG2;形成穩(wěn)定細胞系，為下一步功能實驗提供研究對象。
　　5.穩(wěn)定細胞系Huh7-S100A8、MHCC-97H-S100A8經(jīng)過抗生素穩(wěn)定篩選成功，HepG2-S100A8篩選失敗。Western blot及Real time-qPCR驗證結果顯示Huh7-S100A8、97H-S100A8蛋白及mRNA表達量均高于空載對照組（Control）。
　　6.在肝癌細胞中轉

8、染S100A8過表達載體后，Huh7-S100A8、MHCC-97H-S100A8增值能力均高于對應的Control組;遷移、侵襲能力也明顯高于Control組;而流式細胞凋亡檢測則無很明顯的趨勢。
　　7.裸鼠皮下成瘤實驗部分，Huh7-S100A8、97H-S100A8組的鼠瘤體積、重量均大于Control組。
　　結論:
　　1.通過公共數(shù)據(jù)庫薈萃分析顯示S100A8特異性位點低甲基化水平與HCC發(fā)生呈正相關。偏

9、倚分析、敏感性分析等提示本次研究薈萃分析的結果具有高度穩(wěn)定性。
　　2.生存分析顯示，低甲基化組的OS和PFS明顯低于高甲基化組，結果具有統(tǒng)計學意義。
　　3.焦磷酸測序技術驗證原發(fā)性肝細胞癌組織與其對應的癌旁組織中cg20070090位點的甲基化水平，顯示癌組織的平均甲基化水(32.93％±14.82％)顯著低于癌旁組織平均甲基化水平(64.91％±4.65％)。
　　4.成功構建了過表達S100A8基因的肝癌細胞系