肝細(xì)胞癌中WIF-1基因異常甲基化與表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景： 肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前發(fā)病率高、治療網(wǎng)難、死亡率高的惡性腫瘤，全球每年約有598,000人死于肝癌。我國肝癌的死亡率在所有惡性腫瘤中居第二位，年死于肝癌的人數(shù)占全世界肝癌年死亡總數(shù)的53％。雖然肝癌的診斷和治療有了長足的進(jìn)步，但生存率在總體水平上變化不是很明顯。因此對肝癌發(fā)病機(jī)制的深入研究對肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，乃至診斷、治療、預(yù)后均具有重要的意義。

2、肝癌發(fā)生的表遺傳學(xué)機(jī)制研究近些年來受到研究者的高度關(guān)注。表遺傳學(xué)機(jī)制主要包括DNA甲基化(methylation)和組蛋白去乙?；?Histone Deacetylation)。現(xiàn)己確切證明基因肩動子異常甲基化與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，基因肩動子區(qū)CpG島甲基化可影響轉(zhuǎn)錄因子與其識別序列結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄，使抑癌基因沉默，因此啟動子CpG島甲基化是除基因突變和染色體物質(zhì)丟失(LOH或等位基因丟失)外，抑癌基因失表達(dá)的第三種機(jī)制，而且在某些情

3、況下是抑癌基因失表達(dá)的唯一機(jī)制。 Wnt通路是一條對胚胎發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用的信號傳導(dǎo)通路，而它的異?；罨瘏⑴c多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展，大約有33％～67％肝癌中發(fā)現(xiàn)有異?；罨膚nt信號。該信號通路的組成成員豐要包括：細(xì)胞外因子(Wnt)、跨膜受體(frizzled)、胞質(zhì)蛋白(B-catenin)及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(TCF)等一系列蛋白。當(dāng)細(xì)胞外因子與受體結(jié)合后，通過一系列胞質(zhì)蛋白的相互作用使β-catenin蛋白在胞質(zhì)內(nèi)累積進(jìn)而入核

4、與轉(zhuǎn)錄因子FCF。共同作用激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。WIF-1(Wnt inhibitory factor-1)序列高度保守，首先在人的視網(wǎng)膜中被證實，定位于人的染色12q14(4)。WIF-1為保守型分泌型蛋白，和sFR-P家族共同屬于第一類Wnt抑制物。WIF-1與Wnt蛋白結(jié)合，阻止了wnt與受體的結(jié)合，使Wnt的經(jīng)典及非經(jīng)典途徑均受到抑制，近年來研究證明在非小細(xì)胞肺癌、消化系統(tǒng)惡性腫瘤、膀胱癌、鼻咽癌、乳腺癌等惡性腫瘤中存在編碼WIF-

5、1的基因肩動子高甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后WIF-1基因沉默，使WIF-1表達(dá)缺失或下調(diào)，最終導(dǎo)致Wnt信號通路異常激活并引起相應(yīng)腫瘤。因此，本研究主要是檢測肝癌中WIF-1基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)情況，探討WIF-1肩動子甲基化對WIF-1表達(dá)的影響及其與肝癌臨床病理的關(guān)系，分析WIF-1甲基化和表達(dá)可否作為判斷肝癌患者的預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物；同時通過研究肝癌細(xì)胞系中WIF-1啟動子高甲基化與表達(dá)的關(guān)系，并應(yīng)用去甲基化作用逆轉(zhuǎn)WIF-l基因沉默

6、，恢復(fù)WIF-1的表達(dá)，以探索其腫瘤治療潛在靶點(diǎn)的可能及價值。 研究目的： 1、研究肝細(xì)胞癌中WIF-1基因甲基化狀態(tài)及其與表達(dá)的關(guān)系。 2、探討肝癌患者WIF-1基因甲基化狀態(tài)和表達(dá)的臨床意義。 材料和方法： 5株肝癌細(xì)胞系(HepG2、Bel7402、SMMC-7721、Chang Liver、PLC/PFPU5)和1株正常肝細(xì)胞系(LO2)，購自上海細(xì)胞研究所。細(xì)胞系培養(yǎng)及5-aza-dc(

7、5-aza-2'-deoxycytidine)處理：肝癌細(xì)胞系(高甲基化)在PRMI-1640含10％小牛血清(GIBCO公司)的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞系在終濃度為2uM的5-aza-dc的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)5天，每24小時換一次培養(yǎng)基和5-aza-dc，5天后提取細(xì)胞基因組DNA和RNA，檢測細(xì)胞系的甲基化狀態(tài)和表達(dá)情況，實驗中同時設(shè)立無5-aza-dc的對照組。 收集2003年1月～2006年4月中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院肝膽外科本

8、組連續(xù)手術(shù)切除的肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織113例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確認(rèn)為肝細(xì)胞癌，所選標(biāo)本中共87例標(biāo)本可抽提出RNA，手術(shù)前未經(jīng)過放射治療和化學(xué)治療。入選病例臨床資料、術(shù)后病理及隨訪資料完整，所有患者隨訪至2008年3月，無失訪病例。 RT-PCR(Reverse Transcriptase-PCR)檢測WIF-1基因mRNA在肝癌細(xì)胞系、正常肝細(xì)胞系和肝細(xì)胞癌及其癌旁組織中的表達(dá)。甲基化特異性PCR(Methylati

9、on-Specific PCR，MSP)方法檢N5株肝癌細(xì)胞系(HepG2、Bel7402、SMMC-7721、Chang Liver、PLC/PFRJ5)和1株正常肝細(xì)胞系(LO2)的甲基化情況，并檢測113例肝細(xì)胞癌和癌旁組織中WIF-1基因的甲基化情況；分析實驗標(biāo)本對應(yīng)患者的臨床資料，包括患者性別、年齡、HbsAg、術(shù)前Child-Pugh分級、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、有無痛栓、有無輸血、術(shù)后TNM分期、是否根治性切除，術(shù)后無瘤生存率

10、及累積生存率，分析肝癌組織中WIF-1基因甲基化和表達(dá)與各臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果： 1.WIF-1基因在4(80％)株肝癌細(xì)胞系(HepG2、Bel7402、SMMC-7721和Chang Liver)中均發(fā)生部分或完全甲基化，而在肝癌細(xì)胞系(PLC/PFRJ5)和正常肝細(xì)胞系(LO2)中未發(fā)生甲基化。RT-PCR檢測，WIF-1基因在發(fā)生了甲基化的4(80％)株肝癌細(xì)胞系中均無表達(dá)，而在未發(fā)生甲基化的肝癌細(xì)胞

11、系和正常肝細(xì)胞系中WIF-1基因高表達(dá)。用5-aza-de處理后RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)2(2/4)株細(xì)胞系HepG2和Chang Liver中WIF-1基因重新表達(dá)。 2.MSP方法檢測113例肝癌中WIF-1基因甲基化率為68.1％(77/113)，癌旁組織為45.1％(51/113)，兩組之間的甲基化率差異有顯著性(P=0.000，PearsonChi-Square)。RT-PCR檢測87例(26例標(biāo)木不能提取RNA)肝癌中W

12、IF-1 mRNA的表達(dá)，陽性率為22.9％(20/87)，而癌旁組織為37.9％(33/87)，兩組之間表達(dá)差異有顯著性(P=0.032，Pearson Chi-Square)。在肝癌組織中，甲基化陽性組的失表達(dá)率為85.9％(49/57)，而甲基化陰性組的失表達(dá)率60.0％(18/30)，低于甲基化陽性組(R=0.293，P=0.007)。 3.在本研究中，肝癌組織中WIF-1基因甲基化狀況和表達(dá)水平與患者的臨床病理因素之間

13、無明顯相關(guān)性，生存分析顯示W(wǎng)IF-1基因有無甲基化與患者預(yù)后無關(guān)，而肝癌組織中WIF-1 mRNA表達(dá)水平為影響患者累積生存時間的獨(dú)立危險因素(P=0.049，Cox Regression)。 結(jié)論： 1.WIF-1基因在肝癌中發(fā)生高頻甲基化，并且與其失表達(dá)相關(guān)。提示該基因異常甲基化可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生。 2.WIF-1基因甲基化率低于其RNA的失表達(dá)率，表明導(dǎo)致該基因失表達(dá)因素除甲基化外可能還存在其他因素。