少弱精癥患者抗氧化基因NRF2的甲基化分析.pdf

1、目的：本研究通過(guò)檢測(cè)不育男性少弱精組和正常男性精液組抗氧化基因NRF2啟動(dòng)子上游408bp-994bp區(qū)共24個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，探討DNA甲基化修飾與不育男性少弱精癥患者之間的關(guān)系，從而從表觀(guān)遺傳學(xué)角度為不育男性少弱精癥的臨床診斷治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：收集臨床精液樣本進(jìn)行精液常規(guī)分析。蛋白酶K-酚氯仿法提取精子基因組DNA并行重亞硫酸鹽修飾；設(shè)計(jì)與精子DNA抗氧化基因NRF2上游特定待檢測(cè)的片段（NRF2啟動(dòng)子上游

2、408bp-994bp區(qū)間）相匹配的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收DNA片段并進(jìn)行分子克??；最后行菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆并挑選15-20個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送測(cè)序，用DNA-MAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.不育男性少弱精癥患者精子畸形率顯著比對(duì)照組高，少弱精組畸形精子指數(shù)TZI平均為為1.5，精子畸形指數(shù)SDI為1.4，其中頭部缺陷數(shù)占97.9％±2.6%，尾部缺陷數(shù)占14%±9.3%，不育男性少弱

3、精癥組各項(xiàng)形態(tài)學(xué)指標(biāo)均高于對(duì)照組。
　　2.不育男性少弱精癥組精子頂體酶活性（39.90±4.85）μIU/106精子比對(duì)照組（82.15±33.11）μIU/106精子顯著下降，這與精子頭部形態(tài)學(xué)的改變相一致。
　　3.兩組精液提取的精子DNA OD260/OD280值均介于1.7~1.9之間，表明所提取的精子DNA純度較好，無(wú)蛋白質(zhì)及RNA污染。
　　4.不育男性少、弱精組和正常精液組抗氧化基因NRF2啟動(dòng)子上游4

4、08bp-994bp共24個(gè)甲基化位點(diǎn)共獲得1431個(gè)正確克隆，最終統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)99%以上的CpG位點(diǎn)呈非甲基化狀態(tài)，單純少精組患者其第7個(gè)甲基化位點(diǎn)缺失率為24.6%，單純?nèi)蹙M患者其第7個(gè)甲基化位點(diǎn)缺失率為26.3%，少、弱精組第7個(gè)甲基化位點(diǎn)缺失率為25%，少（和或）弱精組第7個(gè)甲基化位點(diǎn)缺失率明顯比對(duì)照組18.14%高。
　　結(jié)論:
　　1.正常生育男性及不育男性少、弱精患者抗氧化基因 NRF2啟動(dòng)子上游408bp~