ROS下調(diào)Nrf2(61 kD)、NRF-1-mtTFA和Nrf2(100 kD)啟動氧化應(yīng)激共同誘導IR的研究.pdf

1、背景：
　　2型糖尿?。═2DM）是一種嚴重危害人類健康的慢性非傳染病，主要特點為胰島素抵抗、β細胞功能障礙及高血糖，可誘發(fā)眼、心、腎、血管和神經(jīng)系統(tǒng)等多種組織器官的并發(fā)癥。T2DM由遺傳因素、環(huán)境因素以及行為因素共同作用導致，發(fā)病機制復(fù)雜。胰島素抵抗是T2DM的主要病理生理機制及治療難點。大量的文獻及本實驗室的研究表明，氧化應(yīng)激在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。此外，線粒體損傷是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵機制。線粒體是細胞內(nèi)生成

2、 ROS的主要部位，也是ROS誘發(fā)氧化損傷的主要靶點。然而，氧化應(yīng)激與線粒體損傷在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用及分子機制還不清楚。
　　Nrf2是一種關(guān)鍵的抗氧化核心轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)一系列抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄因子 NRF-1通過調(diào)節(jié) mtTFA，在調(diào)控線粒體生物發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。文獻報道，Nrf2對NRF-1的轉(zhuǎn)錄、線粒體生物發(fā)生及心肌保護有一定調(diào)控作用。然而，在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中，Nrf2和NRF-1是否

3、存在相互作用還有待研究。
　　本課題通過高脂飲食飼喂構(gòu)建胰島素抵抗動物模型，研究在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激、線粒體結(jié)構(gòu)、功能及關(guān)鍵分子Nrf2和NRF-1、mtTFA等的變化特點；研究T2DM模式動物db/db鼠關(guān)鍵分子Nrf2、NRF-1、mtTFA變化特點；并在L02人正常肝細胞系中，通過轉(zhuǎn)染pCDNA3-Myc3-Nrf2質(zhì)粒，研究Nrf2對抗氧化酶及NRF-1、mtTFA等分子的調(diào)控機制。研究結(jié)果試圖為發(fā)現(xiàn)新的胰

4、島素抵抗發(fā)病機制提供有價值的基礎(chǔ)資料，為制定有效的干預(yù)措施提供重要的實驗與理論依據(jù)。
　　目的：
　　1．研究高脂飲食飼喂誘導胰島素抵抗、肝脂肪變、氧化應(yīng)激及線粒體損傷的動態(tài)變化特點。
　　2．研究胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中Nrf2、NRF-1、mtTFA的動態(tài)改變。
　　3．研究Nrf2、NRF-1、mtTFA動態(tài)改變介導胰島素抵抗的分子機制。
　　方法：
　　1．高脂飲食飼喂構(gòu)建胰島素抵抗動物模型：

5、采用含10％脂肪的高脂飲食飼喂，第8周和第12周測定葡萄糖/胰島素耐量，第16至28周每4周測定葡萄糖/胰島素耐量及其他分子生物學指標。
　　2．胰島素敏感性相關(guān)指標測定：動物禁食過夜，使用Roche血糖儀、血糖試紙測定空腹血糖；腹腔注射葡萄糖（1 g·kg-1）/胰島素（0.75 IU·kg-1），測定葡萄糖/胰島素耐量；取血清，使用 ELISA試劑盒測定胰島素含量；計算 HOMA-IR；處死前30 min腹腔注射胰島素（10

6、IU·kg-1）測定胰島素信號。
　　3．肝臟形態(tài)學指標檢測：油紅 O染色觀察肝脂肪變程度；天狼猩紅-苦味酸染色觀察肝纖維化。
　　4．氧化應(yīng)激相關(guān)指標測定：活性氧熒光探針DHE檢測ROS；試劑盒檢測MDA、GSSG/GSH及抗氧化酶活性。
　　5．線粒體相關(guān)指標測定：透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)變化；液相氧電極檢測耗氧量。
　　6．細胞模型構(gòu)建：在L02細胞系中轉(zhuǎn)染pCDNA3-Myc3-Nrf2質(zhì)粒，過表達Nrf2

7、。
　　7．關(guān)鍵分子測定：Western Blot檢測Nrf2、NRF-1、mtTFA、P-Akt、SREBP1c及多種抗氧化酶表達水平。
　　結(jié)果：
　　1．高脂IR動物葡萄糖耐量第12周起受損，血糖、胰島素依次升高，第24周發(fā)生胰島素耐量受損，胰島素信號分子P-Akt第20周起降低，HOMA-IR始終升高；db/db鼠血糖、HOMA-IR升高，胰島素降低。
　　2．高脂IR動物肝脂肪變、肝纖維化逐漸加重，脂質(zhì)

8、合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SREBP1c表達第20-24周升高，第28周降至對照水平；db/db鼠發(fā)生嚴重肝脂肪變，SREBP1c顯著升高。
　　3．高脂IR動物肝臟ROS水平第16周升高，第24周后降低，MDA含量升高，抗氧化酶表達第16周升高，第28周降低；db/db鼠肝MDA、GSSG/GSH升高，CAT、SOD活性升高，GPx活性降低、表達升高，其余抗氧化酶表達無顯著改變； L02細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒80 h后抗氧化酶表達升高。
　　

9、4．高脂IR動物肝線粒體第16周起形態(tài)異常，逐漸加重；耗氧量第16周升高，第20周降低。
　　5．高脂IR動物Nrf2（100 kD）第16-20周升高，第24-28周降低，Nrf2（61 kD）、NRF-1、mtTFA降低；db/db鼠Nrf2（100 kD）無顯著變化，Nrf2（61 kD）、NRF-1、mtTFA降低；L02細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒80 h后Nrf2（100 kD）升高，Nrf2（61 kD）、NRF-1、mtTFA無顯

10、著變化。
　　結(jié)論：
　　1．肝脂肪變、氧化應(yīng)激及線粒體損傷在高脂飲食誘導的胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展中逐漸加重。
　　2．Nrf2、NRF-1、mtTFA在高脂飲食誘導的胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展中存在動態(tài)變化，并與肝脂肪變、氧化應(yīng)激及線粒體損傷密切相關(guān)。
　　3．與野生型小鼠相比，T2DM模式動物db/db鼠存在Nrf2、NRF-1、mtTFA改變。
　　4．過量ROS通過抑制Nrf2（100 kD），削弱抗氧化防御系