版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領
文檔簡介
1、目的:研究Keap1基因沉默對Nrf2相關(guān)基因表達在砷致皮膚細胞毒性中的作用,為砷致皮膚損傷提供理論依據(jù)。
方法:1.慢病毒載體的構(gòu)建。依據(jù)Keap1基因序列構(gòu)建Keap1shRNA,采用BamH I,EcoR I雙酶切載體,T4ligase連接載體與目的基因,經(jīng)感受肽細胞轉(zhuǎn)化后,平板挑菌培養(yǎng),菌液測序。2.慢病毒包裝。陽性質(zhì)粒大量抽提擴增,共轉(zhuǎn)293T細胞,收集病毒上清,測定病毒滴度。3.構(gòu)建沉默Keap1的HaCaT細胞系
2、。不同的慢病毒載體(空載體、Keap1 shRNA1/2/3)分別感染HaCaT細胞,感染復數(shù)(MOI)為5,48小時后,1μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。4.穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定。培養(yǎng)上述經(jīng)過篩選獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,提RNA并定量,通過實時熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測細胞中Keap1 mRNA表達水平。5.采用MTT還原法檢測細胞生長狀況,確定LC50及染毒濃度,染毒濃度分別為LC50的1/100、1/50、1
3、/10。6.流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。7.RT-PCR檢測細胞中Nrf2、Keap1、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表達水平。8.ELISA試劑盒檢測細胞中GSH、HO-1、As3MT蛋白表達水平。
結(jié)果:1.慢病毒干擾載體構(gòu)建,經(jīng)基因測序,顯示與目的基因序列完全匹配。2.慢病毒滴度測試結(jié)果,為2×108TU/ml。3.建立的Keap1-KD穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中sh1最好,其基因的沉默效率為71%,作為
4、后續(xù)實驗細胞。4.混合砷染毒模型細胞48h的LC50為290.00μmol/L,染毒濃度分別為LC50的1/100為2.90μmol/L,LC50的1/50為5.80μmol/L,LC50的1/10為29.00μmol/L。5.2.90μmol/L混合砷染毒促進細胞增殖,抑制細胞凋亡;隨染毒濃度增加(5.80μmol/L-29.00μmol/L)染毒時間(48h、72h)延長增殖水平下降,凋亡率迅速上升。6.低劑量(2.90、5.80μ
5、mol/L)短時間(8h、24h)混合砷染毒促進模型細胞中Nrf2、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA的表達,與對照組相比表達上調(diào):高劑量(29μmol/L)長時間(72h)混合砷染毒抑制模型細胞中各基因的表達,與對照組相比表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。7.低劑量(2.90、5.80μmol/L)短時間(24h、48h)混合砷染毒模型細胞能促進As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達,隨染毒濃度(29
6、μmol/L)增加時間延長(72h),As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達量有所下降,但仍遠高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結(jié)論:1.混合砷染毒能改變細胞中增殖與凋亡的比率,低劑量促進細胞增殖,抑制細胞凋亡,高劑量抑制細胞增殖,促進細胞凋亡。2.混合砷染毒模型細胞,Nrf2高表達,隨著染毒時間延長、染毒濃度增加基因有下調(diào)趨勢,但明顯高于未轉(zhuǎn)染組。3.混合砷染毒能使模型細胞中Bach1、MAPK/ERK、CBP
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 砷對Nrf2相關(guān)基因及抗氧化指標影響研究.pdf
- 沉默Keap1基因?qū)腔嚓P(guān)基因和砷代謝相關(guān)指標的影響及在砷皮膚角化異常中的作用.pdf
- 家蠅Keap1和Nrf2基因的克隆、表達及功能分析.pdf
- Nrf2在大鼠HSC氧化應激損傷中的作用及機制.pdf
- Nrf2和Keap1在喉鱗狀細胞癌中的表達及意義.pdf
- 阻滯Nrf2基因?qū)ι橹缕つw角化相關(guān)基因及蛋白的影響研究.pdf
- Nrf2對NAFLD模型鼠胰島素抵抗和氧化應激基因表達的影響.pdf
- 三氧化二砷對前列腺癌DU145細胞中KEAP1基因表達作用研究.pdf
- 阻滯NRF2后砷對NRF2抑制因子的影響及與MAPK基因關(guān)系.pdf
- 姜黃素對急性高脂血癥大鼠氧化應激及腹主動脈Nrf2表達的影響.pdf
- 抗氧化應激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在血管鈣化發(fā)生中的作用及機制研究.pdf
- 砷對皮膚細胞凋亡及角化相關(guān)基因表達的影響與早期皮膚損傷研究.pdf
- Nrf2信號通路在阿特拉津致鵪鶉肝臟氧化應激中的作用.pdf
- Nrf2對NAFLD模型小鼠脂質(zhì)代謝及相關(guān)基因表達的影響.pdf
- Nrf2信號通路在鉛致SH-SY5Y細胞氧化應激中的作用.pdf
- Keap1-Nrf2通路在子癇前期氧化應激發(fā)病機制中調(diào)控作用的研究.pdf
- Keap1-Nrf2啟動子區(qū)甲基化及其對Nrf2下游抗氧化基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控在燃煤型砷中毒的作用.pdf
- nkx2.5在氧化應激抑制nsd1基因表達中的作用研究
- ROS下調(diào)Nrf2(61 kD)、NRF-1-mtTFA和Nrf2(100 kD)啟動氧化應激共同誘導IR的研究.pdf
- Nrf2在潰瘍性結(jié)腸炎患者中的表達及其與氧化應激的關(guān)系.pdf
評論
0/150
提交評論