沉默Keap1基因?qū)rf2相關(guān)基因表達的影響及在砷皮膚氧化應激損傷中作用.pdf

1、目的：研究Keap1基因沉默對Nrf2相關(guān)基因表達在砷致皮膚細胞毒性中的作用，為砷致皮膚損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：1.慢病毒載體的構(gòu)建。依據(jù)Keap1基因序列構(gòu)建Keap1shRNA,采用BamH I，EcoR I雙酶切載體,T4ligase連接載體與目的基因，經(jīng)感受肽細胞轉(zhuǎn)化后，平板挑菌培養(yǎng)，菌液測序。2.慢病毒包裝。陽性質(zhì)粒大量抽提擴增，共轉(zhuǎn)293T細胞，收集病毒上清，測定病毒滴度。3.構(gòu)建沉默Keap1的HaCaT細胞系

2、。不同的慢病毒載體（空載體、Keap1 shRNA1/2/3）分別感染HaCaT細胞，感染復數(shù)（MOI）為5，48小時后，1μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。4.穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定。培養(yǎng)上述經(jīng)過篩選獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，提RNA并定量，通過實時熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測細胞中Keap1 mRNA表達水平。5.采用MTT還原法檢測細胞生長狀況，確定LC50及染毒濃度，染毒濃度分別為LC50的1/100、1/50、1

3、/10。6.流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。7.RT-PCR檢測細胞中Nrf2、Keap1、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表達水平。8.ELISA試劑盒檢測細胞中GSH、HO-1、As3MT蛋白表達水平。
　　結(jié)果：1.慢病毒干擾載體構(gòu)建，經(jīng)基因測序，顯示與目的基因序列完全匹配。2.慢病毒滴度測試結(jié)果，為2×108TU/ml。3.建立的Keap1-KD穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中sh1最好，其基因的沉默效率為71％,作為

4、后續(xù)實驗細胞。4.混合砷染毒模型細胞48h的LC50為290.00μmol/L，染毒濃度分別為LC50的1/100為2.90μmol/L，LC50的1/50為5.80μmol/L，LC50的1/10為29.00μmol/L。5.2.90μmol/L混合砷染毒促進細胞增殖，抑制細胞凋亡；隨染毒濃度增加（5.80μmol/L-29.00μmol/L）染毒時間（48h、72h)延長增殖水平下降，凋亡率迅速上升。6.低劑量（2.90、5.80μ

5、mol/L）短時間（8h、24h）混合砷染毒促進模型細胞中Nrf2、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA的表達，與對照組相比表達上調(diào)：高劑量（29μmol/L）長時間（72h）混合砷染毒抑制模型細胞中各基因的表達，與對照組相比表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。7.低劑量（2.90、5.80μmol/L）短時間（24h、48h）混合砷染毒模型細胞能促進As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達，隨染毒濃度（29

6、μmol/L）增加時間延長（72h），As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達量有所下降，但仍遠高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.混合砷染毒能改變細胞中增殖與凋亡的比率，低劑量促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，高劑量抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。2.混合砷染毒模型細胞，Nrf2高表達，隨著染毒時間延長、染毒濃度增加基因有下調(diào)趨勢，但明顯高于未轉(zhuǎn)染組。3.混合砷染毒能使模型細胞中Bach1、MAPK/ERK、CBP