轉(zhuǎn)popW基因煙草的鑒定及其抗病抗氧化分析.pdf

1、Harpin蛋白是革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的一類效應(yīng)蛋白，酸性，富含甘氨酸，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感，大多數(shù)對(duì)寄主植物具有毒性，能在非寄主植物上引起過(guò)敏反應(yīng)并激發(fā)植物的多種有益反應(yīng)。外源施用harpin蛋白能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性，增強(qiáng)植物對(duì)多種病害和蚜蟲(chóng)的抗性，提高植物的耐旱性，同時(shí)能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
　　PopW基因是克隆于青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum ZJ3721中的一種編碼har

2、pin蛋白的基因，其編碼的PopW蛋白同以前報(bào)道的harpin類物質(zhì)具有相同的性質(zhì):酸性，富含甘氨酸和絲氨酸，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感。原核表達(dá)的PopW蛋白處理煙草能夠誘導(dǎo)煙草對(duì)TMV的抗性、促進(jìn)煙草生長(zhǎng)、提高煙草品質(zhì)。為了進(jìn)一步研究popW的功能，實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了轉(zhuǎn)popW基因的煙草。本文通過(guò)卡那霉素抗性篩選、PCR檢測(cè)、PCR-Southern blot、RT-PCR分析以及GUS染色對(duì)T1到T3代的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了篩選和鑒定，獲得

3、了21個(gè)T3代的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株株系。PCR分析、PCR-Southern blot以及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，popW基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，并在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。GUS染色進(jìn)一步證明popW基因在翻譯水平上進(jìn)行了表達(dá)，且不同株系之間表達(dá)存在差異。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行生長(zhǎng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)popW基因能促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)。在MS平板上生長(zhǎng)15d后，轉(zhuǎn)基因煙草的根長(zhǎng)最高為非轉(zhuǎn)基因煙草植株的1.67倍，移栽后60 d的株高、鮮重和干重最高分別為非轉(zhuǎn)

4、基因煙草植株的1.57、1.83和1.81倍。
　　前期的研究表明PopW蛋白能夠通過(guò)水楊酸信號(hào)途徑誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性。為了進(jìn)一步探究PopW的功能以及其作用機(jī)制，本文對(duì)轉(zhuǎn)popW基因煙草進(jìn)行了研究，在溫室條件下對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行煙草花葉病毒(TMV)病和青枯病的抗病性測(cè)定，并研究了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV和青枯病的抗病機(jī)制。對(duì)TMV的抗病性測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV的抗病性增強(qiáng)，防效最高達(dá)54.25％。接種TMV后，轉(zhuǎn)

5、基因煙草中H2O2的含量變化呈現(xiàn)出了典型的雙峰模式，并且含量高于非轉(zhuǎn)基因煙草的峰值。接種TMV后，防御酶PAL、PPO和POD的活性也高于非轉(zhuǎn)基因煙草。對(duì)防衛(wèi)相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種TMV前，轉(zhuǎn)基因煙草中與水楊酸(SA)應(yīng)答和過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)(HR)的基因的表達(dá)量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草，接種TMV后這些基因的表達(dá)均被顯著誘導(dǎo)。嫁接實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，轉(zhuǎn)基因煙草中的抗病信號(hào)是可以傳遞的系統(tǒng)信號(hào)。對(duì)青枯病的抗病性測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)popW基因也

6、增強(qiáng)了煙草對(duì)青枯病的抗性，防效最高達(dá)81.32％。接種青枯菌后，轉(zhuǎn)基因煙草中產(chǎn)生了大量的活性氧及過(guò)敏性細(xì)胞死亡，使青枯菌在轉(zhuǎn)基因煙草中的增殖受到了抑制。對(duì)防衛(wèi)相關(guān)基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，將popW轉(zhuǎn)入煙草后增強(qiáng)了煙草中與水楊酸(SA)、乙烯(ET)和茉莉酸(JA)信號(hào)通路以及過(guò)敏反應(yīng)(HR)相關(guān)基因的表達(dá)。
　　在對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的研究過(guò)程中，轉(zhuǎn)popW基因煙草的種子在含低濃度H2O2的MS平板上能夠正常萌發(fā)，而非轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)卻受到了

7、抑制，因此，推測(cè)轉(zhuǎn)popW基因可能增強(qiáng)了煙草對(duì)氧化脅迫的耐受性。本文在溫室條件下研究了轉(zhuǎn)popW基因煙草對(duì)氧化脅迫的耐受性，分析了轉(zhuǎn)基因煙草耐氧化脅迫的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)基因煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草減輕了外源H2O2對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。在百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞受損傷的程度顯著小于非轉(zhuǎn)基因煙草。同時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化酶系POD、SOD、CAT的活性及抗壞血酸的含量都顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草，最大分別為非轉(zhuǎn)基因煙草的1

8、.95、1.68、1.33和1.34倍。轉(zhuǎn)基因煙草中氧化脅迫應(yīng)答相關(guān)基因NtAPX, NtCA T1，NtGST及NtCu/Zn-SOD的表達(dá)量也顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草，百草枯處理后其表達(dá)量最高分別為非轉(zhuǎn)基因煙草的1.94、2.36、5.24和3.62倍。
　　這些結(jié)果表明，異位表達(dá)popW基因賦予了煙草對(duì)病害和氧化脅迫的雙重抗性。一方面，通過(guò)激活煙草的抗病信號(hào)通路，誘導(dǎo)防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)增強(qiáng)煙草對(duì)TMV和青枯病的抗性;另一方面