轉(zhuǎn)pvpgip2基因小麥的獲得與紋枯病抗病性鑒定

1、轉(zhuǎn)PvPGIP2PvPGIP2基因小麥的獲得與基因小麥的獲得與紋枯病紋枯病抗病性鑒定鑒定王金鳳12，李釗2，杜麗璞2，黃素萍12，徐惠慧君2，馮斗1，張增艷2（1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院南寧5300042中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程農(nóng)業(yè)部麥類作物生物和遺傳改良重點實驗室北京100081）摘要:多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一種植物防衛(wèi)蛋白，可阻止一些病原真菌的侵害。本研究克隆出扁豆PvPGIP2基因

2、編碼序列，構(gòu)建了受玉米泛素(ubiquitin)啟動子控制的PvPGIP2基因表達載體pA25PvPGIP2；采用基因槍法將pA25PvPGIP2轉(zhuǎn)化小麥推廣品種揚麥18幼胚愈傷組織4000塊，獲得了203株再生植株。PCR檢測出陽性植株65株，轉(zhuǎn)化率為1.625%。對轉(zhuǎn)PvPGIP2基因小麥T1T2代植株，進行外源基因的PCR、RTPCR、熒光定量RTPCR(QRTPCR)分析和小麥紋枯病抗性鑒定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入的PvPGIP2能夠在

3、轉(zhuǎn)基因小麥中遺傳、轉(zhuǎn)錄與表達；PvPGIP2基因的表達提高了轉(zhuǎn)基因植株對小麥紋枯病的抗性。關(guān)鍵詞：PvPGIP2基因；轉(zhuǎn)基因小麥；小麥紋枯??；抗性DevelopmentacterizationofPvPGIP2TransgenicWheatPlantswithEnhancedResistancetoRhizoctoniacerealis（1CollegeofAgronomyGuangxiUniversityNanningGuangxi5

4、300042NationalKeyFacilityfCropGeneResourcesGeicImprovementKeyLabatyofBiologyGeicImprovementofTriticeaeCropsMinistryofAgricultureInstituteofCropSciencesChineseAcademyofAgriculturalSciencesBeijing100081）Abstract：Polygalact

5、urcuaseinhibingproteins(PGIPs)aredefenseproteinsproducedinplantswhichcaninhibitthegrowthofpathogenicfungi.InthisstudythecodingsequenceofthebeanPGIPgenePvPGIP2wascloneditstransfmationvectpA25PvPGIP2wasconstructedinwhichth

6、eexpressionofPvPGIP2wasdrivedbythemaizeubiquitinpromoter.Atotalof4000embryocallusofwheatvarietyYangmai18werebombardedbytheparticlecontainingpA25PvPGIP2203regeneratedplantswereobtained.ByPCRspecifictothetransgene65positiv

7、etransgenicplantswereidentifiedintheT0generationthusthetransfmationfrequencywas1.625%.ThetransgenicwheatplantsinT1T2generationsweresubjectedtoPCRRTPCRQRTPCRanalysesdiseaseresistanceevaluationfollowinginoculationswithRhiz

8、octoniacereali.TheresultsshowedthattheintroducedalienPvPGIP2geneinthesetransgenicwheatplantscouldbeinheritedexpressedinthewheatplantscouldbeinheritedexpressedinthewheatbackground.收稿日期：基金項目：國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2011ZX080020

9、01，2009ZX08002006B)作者簡介：王金鳳，碩士研究生，主要從事小麥抗病分子育種研究；通訊作者:馮斗，副教授，主要從事作物遺傳育種和基因工程教學(xué)與研究；張增艷研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事小麥抗病分子生物學(xué)與分子育種研究，Email:etransgenicwheatplantsexpressingPvPGIP2showedenhancedresistancetoR.cerealiscomparedwithvulgaris）英國

10、紅種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所宗緒曉研究員提供。質(zhì)粒pAHC25由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥分子育種組保存；限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、SacI和TaqDNApolymerase、T4DNApolymerase購自大連寶生物公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10菌株、瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京天根生物技術(shù)公司。Ampicillin(Amp.)購自北京拜爾迪公司。引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。1.2方法1.2.1

11、PvPGIP2基因克隆及植物表達載體的構(gòu)建利用TRIZOL試劑（Invitrogen公司）提取菜豆英國紅的葉片總RNA。用RNAPCRkitver.3.0試劑盒（Takara）合成第一條鏈cDNA。以該cDNA為模板，按照PvPGIP2（FM253101）和Sun等[19]公布的EST序列（DN551584）序列，設(shè)計1對基因特異引物PvPGIP2U:5′GCAACCATGTCCTCAAGC3′和PvPGIP2L:5′ATGATTAAG

12、TGCAGGCAGG3。采用TaqplusDNA聚合酶（Takara）和PCR反應(yīng)標準體系，擴增得到1012bp的PvPGIP2基因產(chǎn)物，回收、純化，克隆于載體pMD18T（Takara），測序分析。結(jié)果表明，所獲得的DNA片段上包含PvPGIP2的完整編碼序列（F）。為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達載體，設(shè)計引物(PvPGIP2OF:5’GACCCGGGATGTCCTCAAGCTTAAGC3’，引入SmaI酶切位點PvPGIP2:5’CACTCGAG