c-myc基因誘導(dǎo)成體細(xì)胞去分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 皮膚是人體最大的器官，位于體表，易于受傷，在皮膚創(chuàng)傷的愈合過程中，表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖、游走，最后覆蓋創(chuàng)面從而完成創(chuàng)面的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞在維持細(xì)胞的自我更新、保持皮膚正常的結(jié)構(gòu)和功能方面起著非常重要的作用，通過激活組織干細(xì)胞可以明顯促進(jìn)創(chuàng)傷的修復(fù)過程。目前創(chuàng)傷領(lǐng)域的去分化研究成為熱點(diǎn)，目前已經(jīng)有研究證實(shí)了創(chuàng)傷過程中的去分化現(xiàn)象，同時(shí)最新的研究也證實(shí)了體外培養(yǎng)的細(xì)胞能夠在一定條件下轉(zhuǎn)化成為多能干細(xì)胞，這

2、對創(chuàng)傷愈合的研究有著積極的促進(jìn)作用。目前干細(xì)胞的來源面臨著很多倫理問題，如何取得足夠的人干細(xì)胞是干細(xì)胞研究的一個(gè)主要問題，如果能將成體細(xì)胞通過去分化誘導(dǎo)成為前體細(xì)胞，就可以避免應(yīng)用胚胎干細(xì)胞帶來的倫理問題。
　　 目前有很多研究已經(jīng)注意到了干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相似之處。腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞都是低分化的細(xì)胞，而且兩者都有很快的生長增殖速度。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤形成的信號通路在去分化的過程中可能起著非常重要的作用，因此我們選擇原癌基因做為研究對

3、象。C-myc被認(rèn)為是與去分化過程關(guān)系最為密切的原癌基因，一方面c-myc是許多腫瘤信號通路的靶基因，同時(shí)c-myc在創(chuàng)傷愈合過程以及一些去分和轉(zhuǎn)分化的過程中均有明顯的表達(dá)。而成纖維細(xì)胞是構(gòu)成皮膚的主要細(xì)胞，被認(rèn)為是一種終末分化的細(xì)胞，在創(chuàng)傷修復(fù)的過程中成纖維細(xì)胞起著非常重要的作用，同時(shí)成纖維細(xì)胞也是構(gòu)成瘢痕的最主要細(xì)胞。正因?yàn)槿绱?，目前?chuàng)傷修復(fù)和瘢痕的研究都把成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡作為研究的重點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過向成纖維細(xì)胞

4、中轉(zhuǎn)染基因以改變細(xì)胞基因表達(dá)的方法觀察體外培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的去分化現(xiàn)象，在此基礎(chǔ)上對去分化現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行初步的探討，同時(shí)在動物模型上進(jìn)一步觀察這種現(xiàn)象的存在，為皮膚創(chuàng)傷研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、原癌基因c-myc轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞
　　 培養(yǎng)正常生長的NIH3T3細(xì)胞，然后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，將原癌基因c-myc導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞中，然后應(yīng)用G418篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，觀

5、察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長情況，同時(shí)檢測細(xì)胞的增殖能力以及細(xì)胞周期的變化。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)，流式細(xì)胞儀檢測以及western blotting等多種方法來檢測c-myc的表達(dá)和成纖維細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白的改變情況。
　　 2、培養(yǎng)正常生長的轉(zhuǎn)染成功表達(dá)c-myc原癌基因的NIH3T3細(xì)胞，對wnt信號通路中一些特異性蛋白進(jìn)行檢測，如wnt4蛋白，β-catenin，同時(shí)與轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞表達(dá)相比較，觀察wnt信號通路在成纖維細(xì)胞去分化過程中所

6、起的作用。
　　 3、制作鼠的動物損傷創(chuàng)面，將原癌基因c-myc質(zhì)粒應(yīng)用于創(chuàng)面周圍，觀察創(chuàng)面的愈合情況，同時(shí)在不同時(shí)間點(diǎn)取創(chuàng)面周圍組織進(jìn)行檢測，對標(biāo)本進(jìn)行HE染色和c-myc， PCNA的免疫組織化學(xué)染色。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)組和對照組指標(biāo)采用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各項(xiàng)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，p＜0.05表示有顯著差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.應(yīng)用c-myc原癌基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3

7、T3細(xì)胞取得成功，經(jīng)過G418篩選后可以得到具有c-myc表達(dá)的成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率大約為10％左右，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長增殖能力較轉(zhuǎn)染前明顯增強(qiáng)，同時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞S期比例明顯增高。G1期比例明顯減少，同時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)c-myc，經(jīng)過westren blotting，免疫組織化學(xué)，以及流式細(xì)胞儀檢測，可見成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物波形蛋白消失?？梢哉J(rèn)為通過改變成體細(xì)胞的基因序列，細(xì)胞增殖速度明顯增快，細(xì)胞的表型發(fā)生改變，初步證明了去分化

8、現(xiàn)象的存在。
　　 2.純化已經(jīng)轉(zhuǎn)染成功的NIH3T3細(xì)胞，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，檢測wnt信號通路相關(guān)的蛋白在轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞中的表達(dá)情況，并與轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞進(jìn)行對比，可以發(fā)現(xiàn)wnt4蛋白，β-catenin的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，這表明wnt信號通路在成纖維細(xì)胞去分化的過程中起著一定的作用。
　　 3.應(yīng)用c-myc原癌基因質(zhì)粒的鼠的創(chuàng)面愈合速度較對照組創(chuàng)面明顯增快，通過對創(chuàng)面周圍組織定期取材免疫組化研究可以發(fā)現(xiàn)，c-myc表達(dá)的維持

9、時(shí)間延長，隨著創(chuàng)面的逐漸愈合，c-myc的表達(dá)逐漸消失，這與正常的創(chuàng)面愈合過程相同。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面的PCNA表達(dá)也明顯增強(qiáng)，通過此實(shí)驗(yàn)可以證明應(yīng)用c-myc所形成的細(xì)胞為非惡性增殖細(xì)胞，可以認(rèn)為是可以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的具有去分化性質(zhì)的細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1、c-myc原癌基因質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，細(xì)胞可以持續(xù)表達(dá)c-myc，細(xì)胞生長增殖速度明顯增快，同時(shí)細(xì)胞的表型發(fā)生了變化，可以認(rèn)為成纖維細(xì)胞發(fā)生了去分化，提