雞傳染性支氣管炎病毒廣西分離株GX-YL5和GX-YL9的全基因組序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)是雞的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，該病由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起，是至今嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)最重要的疫病之一，給養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來巨大損失。
　　 為更加全面探討IBV廣西分離株的分子變異機(jī)制、致病機(jī)理和毒力進(jìn)化特征，本研究采用基因組引物測(cè)序法對(duì)致病性強(qiáng)、與常用疫苗株血清型不同的代表性廣西分離株GX-

2、YL5和GX-YL9進(jìn)行全基因組序列的測(cè)定。根據(jù)GenBank公布的IBV全基因組序列（SAIBK，H52和A2），使用相關(guān)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及引用一部分已發(fā)表引物。測(cè)序結(jié)果表明分離株GX-YL5和GX-YL9的基因組全長分別為27720bp和27597bp，Genebank登錄號(hào)分別為HQ848267.1和HQ850618.1。
　　 基因注釋結(jié)果表明兩分離株均符合冠狀病毒IBV的基因組結(jié)構(gòu)特征，為IBV經(jīng)典的基因組結(jié)構(gòu)：5'-

3、UTR-Pol-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。
　　 IBV廣西分離株GX-YL5和GX-YL9的生物信息學(xué)分析包括全基因組核苷酸序列的插入與缺失分析、全基因組的同源性分析、全基因組序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、結(jié)構(gòu)蛋白基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、重組預(yù)測(cè)及以分離株GX-YL5為模型的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。
　　 全基因組序列的插入與缺失分析表明分離株GX-YL5和GX-YL9主要在基因組核苷酸3226-3561位、

4、20429-20830位、21238-21378位、24064-24253位、24559-25579位、27193-27405位存在明顯的堿基插入和缺失現(xiàn)象。全基因組同源性分析結(jié)果表明，IBV廣西分離株GX-YL5和GX-YL9的全基因組核苷酸序列均與CQ04-1株的相似度最高，均為94.7％，說明兩分離株與CQ04-1株最有可能具有同源性；而分離株GX-YL5和GX-YL9的全基因組核苷酸序列均與Georgia 1998 pass8株

5、的相似度最低，均為84.3％，說明兩分離株和Georgia 1998 pass8株親緣關(guān)系可能最遠(yuǎn)。
　　 結(jié)構(gòu)蛋白基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明，IBV廣西分離株GX-YL5和GX-YL9的主要與毒株SC021202、SAIBK、CQ04-1、DY07和A2位于較近發(fā)育分支上，同時(shí)，IBV廣西分離株GX-YL5和GX-YL9的結(jié)構(gòu)蛋白基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一定程度上體現(xiàn)出與全基因序列水平的不一致性，這可能與IBV特殊轉(zhuǎn)錄機(jī)制導(dǎo)致的重

6、組現(xiàn)象有關(guān)，也說明想要獲得IBV全基因組層面的進(jìn)化關(guān)系，全基因組序列的測(cè)定具有必要性。
　　 重組預(yù)測(cè)結(jié)果表明分離株GX-YL5和GX-YL9結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)段(S-3UTR)具有較多重組區(qū)域。分離株GX-YL5的S蛋白S2亞基段有一個(gè)約400bp的類CQ04-1和DY07重組片段，可能的重組位點(diǎn)位于其基因組核苷酸第22523位，另外M蛋白、N蛋白和3UTR區(qū)均有被預(yù)測(cè)的重組位點(diǎn)，分別位于基因組核苷酸第24741、26103和2722

7、3位。分離株GX-YL9在其基因組3a蛋白、M蛋白、5a蛋白和N蛋白處均有被預(yù)測(cè)的重組位點(diǎn)，分別為基因組第23805、24530、25702和26166位。
　　 本研究結(jié)合冠狀病毒的不連續(xù)轉(zhuǎn)錄機(jī)制從分子結(jié)構(gòu)層面對(duì)被預(yù)測(cè)發(fā)生于IBV分離株GX-YL5的重組現(xiàn)象進(jìn)行了研究和解釋。
　　 RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，分離株GX-YL5基因組前導(dǎo)序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)I與核苷酸相似率高的毒株比較，具有較多核苷酸突變位點(diǎn)，毒株間的重組

8、有可能依賴于這一莖環(huán)結(jié)構(gòu)的高突變性。而分離株GX-YL5中ORF1b與S蛋白融合區(qū)的一個(gè)疏水性氨基酸區(qū)域（信號(hào)肽區(qū)域）在冠狀病毒中具有較高的保守性，RNA折疊預(yù)測(cè)為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，有可能是發(fā)生重組的關(guān)鍵部位。綜合來說，IBV毒株間的重組有可能依賴于前導(dǎo)序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)I高突變效應(yīng)和ORF 1b 融合區(qū)RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)共同造成的宿主特異性穩(wěn)定狀態(tài)，從而造成在共感染情況下毒株間亞基因組mRNAs和其它形式的重組現(xiàn)象較為普遍。
　　 結(jié)合毒株分離

9、地情況，暗示IBV毒株間的重組可能一定程度上由地理空間因素所引起，這一情況使得IBV特殊的不連續(xù)轉(zhuǎn)錄機(jī)制具有適宜于其發(fā)生的壓力環(huán)境，從而造成了不同毒株間重組現(xiàn)象的發(fā)生。
　　 本研究獲得了IBV廣西分離株GX-YL5和GX-YL9的全基因組序列，并上傳至Genebank，豐富了冠狀病毒生物數(shù)據(jù)庫信息，也為開展IBV反向遺傳技術(shù)研究IBV分子生物學(xué)特性提供了依據(jù)，為新型疫苗和治療性藥物的研制與開發(fā)奠定基礎(chǔ)；預(yù)測(cè)得到了分離株GX-Y