強(qiáng)化磷酸三鈣-富血小板血漿凝膠復(fù)合支架材料的制備及在體內(nèi)成骨的研究.pdf

1、創(chuàng)傷、骨腫瘤手術(shù)切除造成的骨缺損，使得現(xiàn)有的骨替代材料已經(jīng)無法滿足臨床需求。骨組織工程當(dāng)今研究的重點(diǎn)，是一種開發(fā)能夠修復(fù)、維持和改善損傷骨組織功能可被機(jī)體吸收的生物替代物來解決大段骨缺損的方法。人們逐步認(rèn)識(shí)到構(gòu)建以支架材料為骨架，復(fù)合干細(xì)胞，輔以生長因子的細(xì)胞繁殖三角模式是組織工程較理想的選擇。本課題根據(jù)骨組織工程的基本原理，設(shè)計(jì)將富血小板血漿與強(qiáng)化磷酸三鈣復(fù)合后加入凝血酶形成復(fù)合材料，構(gòu)建新型強(qiáng)化磷酸三鈣-膠原-多種生長因子(PRP)

2、復(fù)合支架，隨后選擇和培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并將種子細(xì)胞與支架相復(fù)合，植入比格犬體內(nèi)觀察其成骨情況，為構(gòu)建理想的初步組織工程骨工程化產(chǎn)品，為建立骨組織工程的大型動(dòng)物模型及進(jìn)一步滿足治療骨缺損的臨床需要提供理論基礎(chǔ)。 目的:研究探討犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，以及生長增殖特性，并將其作為骨組織工程種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:無菌技術(shù)抽取比格犬骨髓，密度梯度離心法獲取細(xì)胞。加入含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為0.1的低糖DMEM培

3、養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)；待細(xì)胞生長至80～90％融合時(shí)，1:3傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。MTT法測定3、5、10代細(xì)胞生長曲線。流式細(xì)胞儀檢測第5代細(xì)胞的表面抗原分子。 結(jié)果:原代培養(yǎng)后24小時(shí)看見微少貼壁細(xì)胞，初起為小圓形，48小時(shí)后可見短梭形、梭形和多角形貼壁細(xì)胞，有初起克隆集落形成，并可見細(xì)胞分裂相；3天后可見梭形類成纖維細(xì)胞明顯增多，5天左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，8～10天單層細(xì)胞融合接近90％，呈漩渦樣生長。1:3傳代的

4、細(xì)胞2小時(shí)左右即可見細(xì)胞貼壁，一般10小時(shí)左右完成貼壁，生長增快，多數(shù)為類成纖維細(xì)胞，圓形細(xì)胞逐漸減少，6～7天細(xì)胞即可單層融合，傳3代以后細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，接近融合狀態(tài)時(shí)可呈漩渦樣生長。10代以后細(xì)胞則逐漸有寬大梭形樣變，增殖逐漸減緩，偶有細(xì)胞飄零。流式細(xì)胞儀檢測傳5代細(xì)胞有96％表達(dá)CD44，95％表達(dá)CD29，而只有5％表達(dá)CD34。生長曲線顯示傳3、5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均有較強(qiáng)的增殖能力，其中傳3代細(xì)胞更為明顯，而傳10代