富血小板血漿凝膠復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細胞在脊髓損傷中的應(yīng)用.pdf

1、[背景和目的]脊髓損傷導(dǎo)致神經(jīng)功能嚴重障礙，哺乳動物脊髓神經(jīng)再生一直是世界性的難題，神經(jīng)不能重新生長并與其下一級神經(jīng)元形成有效的突觸聯(lián)系，往往歸因于脊髓損傷后形成的空洞及其堆積的星型膠質(zhì)細胞阻礙了神經(jīng)的再生以及中樞神經(jīng)本身再生能力較差等原因?；蛐揎椀母杉毎浦仓委熂顾钃p傷在很多試驗中都表現(xiàn)出很大的潛能，其中以骨髓間充質(zhì)干細胞(Bonemarrowstromalcell，BMSC)具備來源廣、增殖快等特點而備受研究者們的青睞。富血小板血

2、漿中含有大量的生長因子，如血小板衍生生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，類胰島素生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，這些生長因子對神經(jīng)的再生都有一定的作用。
　　 腦源性神經(jīng)生長因子(Brain-derivedneutrophicfactor，BDNF)已被證實有促進皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)再生的作用，PRP和BDNF共同作用被證實能誘導(dǎo)BMSC向神經(jīng)元形態(tài)方向分化。PRP和BMS

3、C在修復(fù)急性面神經(jīng)損傷時具有協(xié)同作用。我們通過體外實驗來證明PRP能否誘導(dǎo)BDNF修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元方向分化，以及在大鼠半橫斷脊髓損傷模型中聯(lián)合BDNF修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞和PRP移植治療后的效果.利用介導(dǎo)BDNF的腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞后，將轉(zhuǎn)染目的基因的BMSC與富血小板血漿(Platelet-richplasma，PRP)混合后分別進行體外和體內(nèi)實驗，以探討PRP與BDNF-MSC在脊髓損傷修復(fù)中的作用。

4、　　 [方法]：體外實驗：3×105BMSC或BDNF-MSC與10μlPRP共培養(yǎng)14天，對照組單純MSC培養(yǎng)；體內(nèi)實驗：1×106BMSC或BDNF-MSC與10μlPRP，充分混合后移植到脊髓半橫斷的SD大鼠中，對照組為單純PRP、單純MSC和BDNF-MSC移植。采用BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分法分別在術(shù)后1天、7天、14天、21天、28天、56天對各組大鼠患肢進行功能評分。術(shù)后1周、4周和8周

5、測定各組大鼠脊髓損傷區(qū)域BDNF的表達量，術(shù)后4、8周用realtime-PCR和westernblot測定總的神經(jīng)絲-200(neurofilament-200,NF-200)、膠質(zhì)酸性纖維蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)的表達量，免疫組織化學(xué)檢測脊髓損傷區(qū)域GFAP和5-HT的表達。
　　 [結(jié)果]：PRP與BDNF修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)后BMSC在NF-200,GFAP和微管

6、相關(guān)蛋白-2(microtubule-associatedprotein2，MAP2)等基因上的表達明顯增加，實驗結(jié)果顯示BDNF修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞能在體內(nèi)表達目的基因，促進脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)絲-200的表達。PRP復(fù)合BDNF修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞能促進脊髓損傷區(qū)域星型膠質(zhì)細胞的生長及遷延，減少星型膠質(zhì)細胞在脊髓損傷交界處堆積，PRP復(fù)合BDNF-MSC組8周后BBB功能評分明顯高于其他各組，星型膠質(zhì)細胞貫穿整個脊髓損傷區(qū)域，將損傷

7、近端和遠端連接起來，5-HT陽性神經(jīng)纖維呈串珠樣線性排列。
　　 [結(jié)論]：
　　 1.構(gòu)建攜帶大鼠腦源性神經(jīng)生長因子的腺病毒載體(Adv-BDNF-EGFP)，轉(zhuǎn)染BMSC并獲得持續(xù)表達BDNF的BMSC。
　　 2.制作了PRP凝膠支架，并在體外證實PRP能促進BMSC和BDNF-MSC向神經(jīng)細胞和星型膠質(zhì)細胞方向分化。
　　 3.在體內(nèi)半橫段脊髓損傷模型上證實PRP復(fù)合BDNF修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞