低溫 3D 打印雙相磷酸鈣-聚乙烯醇-富血小板纖維蛋白支架的制備及其成骨作用研究.pdf

1、研究背景：
　　大段骨缺損的修復(fù)一直是困擾骨科醫(yī)生的難題，目前修復(fù)策略包括自體骨、異體骨和人工材料移植等。自體骨移植雖是治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但移植過程中會(huì)造成取骨區(qū)出血、感染；同種異體骨移植存在著免疫排斥、傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)；骨組織工程的迅速發(fā)展給大段骨缺損的修復(fù)提供了一種較為可行的方法。傳統(tǒng)方法制備支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)往往是不可人為控制的，而3D打印技術(shù)可針對(duì)骨缺損的形狀為患者量身定做支架外形；同時(shí)，由于制作過程受到電腦的嚴(yán)格操控，可以精細(xì)控制

2、支架的孔徑、孔道連通率，這對(duì)支架發(fā)揮功能具有重要的作用。
　　3D打印過程中，生物陶瓷漿料從打印噴頭擠出，通過疊層制造的方法堆積成型，漿料中可以加入生物因子或者特定藥物，整個(gè)打印過程控制在低溫下進(jìn)行，含有生物因子或者藥物的漿料通過打印噴頭擠出，不破壞生物因子和藥物的活性。雙相磷酸鈣(BCP)是一種生物陶瓷材料，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性，目前較多的應(yīng)用于骨組織工程、骨水泥等的相關(guān)研究。聚乙烯醇（PVA）以其良好的生物安全性和

3、力學(xué)特性備受研究者青睞。富血小板纖維蛋白（PRF）是第二代血小板濃聚物，制備方法簡(jiǎn)單，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)羅大量血小板激活釋放的生物因子，隨著纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的降解緩慢釋放，促進(jìn)PRF置入部位的組織愈合。目前，鮮有將以上三種材料混合進(jìn)行低溫3D打印骨組織工程支架的報(bào)道。本研究以BCP/PVA/PRF為原料，按照BCP粉末質(zhì)量/PVA溶液體積/血液體積1：1：1的比例于4℃條件下打印成孔徑可控的三維多孔支架，對(duì)照組選用傳統(tǒng)的注模成型技術(shù)制備。本

4、研究通過測(cè)定各組支架的表征、體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)支架細(xì)胞學(xué)作用，體內(nèi)植入橈骨缺損觀察缺損修復(fù)的效果，比較不同方法制備支架的促成骨作用。
　　研究目的：
　　1、分別通過3D打印制備BCP/PVA支架、BCP/PVA/PRF支架和使用注模成型法制備非打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，比較四組支架理化性質(zhì)。
　　2、通過對(duì)接種于不同支架上的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的粘附、增殖和成骨分化的進(jìn)行觀察，體外實(shí)驗(yàn)比

5、較四組支架的細(xì)胞相容性。
　　3、通過兔橈骨臨界性骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)，比較四組支架促進(jìn)骨缺損修復(fù)的能力。
　　研究方法：
　　1、3D打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，注模成型法制備非打印BCP/PVA支架以及BCP/PVA/PRF支架，利用掃描電鏡（SEM）觀察打印支架的宏觀孔隙結(jié)構(gòu)以及表面微結(jié)構(gòu)；測(cè)定接觸角、孔隙率、壓縮模量和親水性。
　　2、提取原代兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，通過流式分析鑒定，鑒定B

6、MSCs純度，CCK8實(shí)驗(yàn)與Annexin V/PI流式分析檢測(cè)四組不同支架的細(xì)胞相容性及毒性，測(cè)定四組支架細(xì)胞種植效率，免疫熒光染色比較細(xì)胞于四組支架的粘附能力。通過CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)吸光值以及掃描電鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況。分別通過測(cè)定支架上細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）活性，qRT-PCR法測(cè)定細(xì)胞COL-1、ALP、RUNX-2、OPN等成骨相關(guān)基因表達(dá)量以評(píng)價(jià)支架誘導(dǎo)細(xì)胞定向成骨分化能力。
　　3、將四組不同支架

7、分別植入兔橈骨臨界性骨缺損模型。分別于4、8、12周取材，通過Micro-CT掃描三維重建觀察新生骨，采用四環(huán)素-鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)實(shí)驗(yàn)測(cè)定礦物沉積率、Van-Gieson染色觀察四組支架促進(jìn)體內(nèi)成骨的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1、掃描電鏡顯示：3D打印支架較注模成型支架具有可控的孔隙結(jié)構(gòu)，支架表面孔徑均勻，材料表面粗糙，打印組支架孔隙率高于非打印組（P＜0.05），但伴隨孔隙率提高的同時(shí)，支架的壓縮模量降低；四組支架材料的

8、親水性能良好，不加PRF的支架接觸角為(72±4.82)°，加入PRF的支架接觸角為(67±4.49)°（P＜0.05）。
　　2、原代培養(yǎng)BMSCs生長(zhǎng)旺盛，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34-CD44+細(xì)胞表面抗原檢測(cè)結(jié)果符合BMSCs特征，CCK8實(shí)驗(yàn)與Annexin V/PI流式檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)四組支架無明顯的細(xì)胞毒性（P＞0.05），而種植效率計(jì)算發(fā)現(xiàn)打印組支架種植效率低于相應(yīng)材料的非打印組（P＜0.05），免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞粘附狀態(tài)

9、發(fā)現(xiàn)打印BCP/PVA/PRF組和非打印BCP/PVA/PRF組支架上細(xì)胞粘附狀態(tài)優(yōu)于非打印BCP/PVA組和打印BCP/PVA組，細(xì)胞種植于支架并培養(yǎng)，3D打印組細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)量最多。細(xì)胞種植于支架并培養(yǎng)至7天時(shí)掃描電鏡結(jié)果顯示四組細(xì)胞均在支架上粘附鋪展良好，打印組材料內(nèi)部孔隙也長(zhǎng)滿細(xì)胞，而非打印組內(nèi)部沒有細(xì)胞長(zhǎng)入。較之空白對(duì)照組，四組支架均促進(jìn)BMSCs的ALP活性表達(dá)，但打印BCP/PVA/PRF組ALP活性最高（P＜0.

10、05），同時(shí)打印BCP/PVA/PRF組的成骨相關(guān)基因于7天及14天表達(dá)量也最高（P＜0.05）。
　　3、Micro-CT三維重建結(jié)果顯示：在4周、8周和12周，打印BCP/PVA/PRF組支架誘導(dǎo)成骨速度最快，成骨量最多，并且隨著新生骨的長(zhǎng)入，支架材料緩慢降解，四組支架的骨修復(fù)效果明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。熒光雙標(biāo)計(jì)算礦物沉積率顯示：四組支架礦化速率顯著高于空白對(duì)照組，打印BCP/PVA/PRF組礦化速率高于打印BC

11、P/PVA組（P＜0.05）。Van-Gieson染色發(fā)現(xiàn)4周時(shí)染成紅色的骨痂包繞著含有PRF的支架，有新生骨組織長(zhǎng)入打印支架的孔隙內(nèi)部；8周時(shí)，負(fù)載有PRF的支架新生骨組織更多，同時(shí)伴隨著新生骨的長(zhǎng)入，支架材料邊緣出現(xiàn)降解；12周時(shí)，在負(fù)載有PRF的支架周圍可見到編織骨及板層骨，并且打印BCP/PVA/PRF組支架大量降解，而其他組板層骨骨質(zhì)薄且不規(guī)則。
　　研究結(jié)論：
　　1、運(yùn)用低溫3D打印技術(shù)可成功制備BCP/PVA

12、/PRF復(fù)合生物支架，打印制備過程可保留PRF中細(xì)胞因子活性，使細(xì)胞因子從支架中緩慢釋放，可控的孔道結(jié)構(gòu)可增加支架孔隙率，但支架的力學(xué)強(qiáng)度也隨之下降。
　　2、支架材料細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)顯示無明顯細(xì)胞毒性，而且 BMSCs在種植支架上粘附良好，并隨著時(shí)間推移增殖迅速，高連通率的孔隙結(jié)構(gòu)使得BMSCs可以長(zhǎng)入支架材料的內(nèi)部，打印支架可促進(jìn)BMSCs的成骨分化。
　　3、含有PRF的打印支架可促進(jìn)體內(nèi)成骨修復(fù)，Micro-CT結(jié)果顯