可注射性磷酸鈣復(fù)合纖維蛋白膠人工骨的研制及其性能.pdf

1、研究目的：研究纖維蛋白膠復(fù)合β-TCP/MCPM骨水泥復(fù)合物的物理學(xué)性能，評價纖維蛋膠對β-TCP/MCPM胃水泥性能的影響。通過對β-TCP/MCPM磷酸鈣骨水泥復(fù)合纖維蛋白膠人工骨物進行體內(nèi)生物安全性實驗研究，探討β-TCP/MCPM磷酸鈣骨水泥復(fù)合纖維蛋白膠人工骨用于骨缺損修復(fù)的可行性，指導(dǎo)臨床用于骨缺損的修復(fù)應(yīng)用。 研究方法： (1)生物材料理學(xué)性能測試 1、凝結(jié)時間的測定采用吉爾摩針法，即用兩支質(zhì)量分別

2、為113和445g，針尖直徑分別為2.1和1.1mm的吉爾摩粗細針進行測試。以不被粗細針留下刺痕的時間分別為初凝和終凝時間。 2、β-TCP/MCPM的抗稀散性取β-TCP/MCPM和β-TCP/MCPM＋FG組骨水泥混合物分別制成小球后，立即置入生理鹽水或蒸餾水(37°)中24h，通過肉眼觀察表面稀散情況進行評價，再放入搖床中稍震蕩看骨水泥小球是否會有甭解。 3、生物力學(xué)樣本的制備及測試稱取適量骨水泥粉末，按β-TCP

3、/MCPM與檸檬酸(或檸檬酸鈉)固液比為1g/0.3ml，混勻后按2.5:1的體積比加入纖維蛋白膠，填入標(biāo)準模具中(內(nèi)徑8mm，高度16mm)，表面摸平后即脫模，37℃，接近100％濕度條件下將試樣養(yǎng)護72h后，標(biāo)示保存：另取單純β-TCP/MCPM粉末按固液比為1g/0.5ml制成標(biāo)準樣品做為對照，取上述磷酸鈣骨水泥試樣用電子式萬能材料試驗機進行抗壓強度的測試，計算材料的抗壓強度。 4、掃描電鏡觀察將β-TCP/MCPM，β-

4、TCP/MCPM＋FG組材料完全干燥后制成自然斷裂樣本，樣本斷裂面經(jīng)真空鍍膜儀表面噴金，掃描電鏡不同放大倍數(shù)下觀察FG與β-TCP/MCPM混合后樣本結(jié)構(gòu)特征，測量材料的孔徑，及兩者材料有無差別。另取β-TCP/MCPM＋FG復(fù)合材料的部分斷裂樣本，在高溫電爐800℃下煅燒8h，經(jīng)真空鍍膜表面噴金后，掃描電鏡觀察樣本的結(jié)構(gòu)特征及孔徑的大小，并計算材料的空隙率。 5、X線衍射(XRD)分析將β-TCP/MCPM粉末與檸檬酸鈉溶液按

5、固液比為1:0.5(g:ml)混合后置于37℃，100％濕度下四周，然后用丙酮浸泡1h，真空干燥，采用XRD分析儀測試化學(xué)成分。 (2)、生物相容性及安全性實驗 ①急性毒性實驗：取體重20±2g的昆明種小鼠，分為材料浸提液原液組和生理鹽水組，分別靜脈注射浸提液原液和生理鹽水，每只注射量1ml。注射24h、48h和72h后稱量小鼠體重，并觀察反應(yīng)。 ②溶血試驗：將新鮮抗凝人血用生理鹽水稀釋成2％人血懸液。在不同的試

6、管中分別加入材料生理鹽水浸提液原液組、生理鹽水(陰性對照)和雙蒸水(陽性對照)2mL。再在每管分別加入2％新鮮健康人血懸液2mL，37℃水浴1h，肉眼觀察有無溶血。1000r/min離心5min。取上清液1mL，加入0.1％Na2CO3溶液4mL，在752型分光光度計540nm處測定各樣本光密度并計算溶血率。 ③微核試驗：取健康昆明種小鼠，體重25～30g，雌雄各半，隨機分為5組；其中3組分別腹腔注射不同劑量的β-TCP/MCP

7、M生理鹽水浸提液(0.1，0.2，0.4ml)，另2組為陰性對照組(生理鹽水)和陽性對照組(環(huán)磷酰胺100mg/kg)。采用四次給藥法，分別間隔24h，于第四次給藥后6h處死動物。取股骨髓制片，瑞特氏(Wright)染色。在油鏡下計數(shù)，每只動物觀察1000個嗜多染紅細胞中含含微核的嗜多染紅細胞數(shù)，計算微核細胞率。 ④細胞毒性實驗取對數(shù)生長期的MC3T3成骨細胞株經(jīng)胰酶消化制成密度為5×104ml的細胞懸液，分別接種于96孔培養(yǎng)板

8、上，每孔100ul，每組5孔。培養(yǎng)24h使細胞貼壁，棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的DMEM/F-12浸提液(原液組，50％原液組，10％原液組)，單純培養(yǎng)液組為陰性對照，含0.64％苯酚的培養(yǎng)液組為陽性對照。置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24，48，72h后取出，每孔加入0.5％MTT20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄培養(yǎng)液，加入二甲亞砜150ul/孔，震蕩5min，酶標(biāo)儀490nm下測定每孔0D值。計算細胞相對增殖率。 研究結(jié)果：

9、 1.凝固時間 結(jié)果顯示添加纖維蛋白膠后可明顯延長該復(fù)合骨水泥材料的初步凝結(jié)時間和終凝時間，終凝時間較初凝時間延遲2～4秒。 2.抗稀散性能 兩者剛投入生理鹽水中材料都無崩解，24小時后β-TCP/MCPM/FG材料表面仍保持較完整，無明顯潰散現(xiàn)象。對照組β-TCP/MCPM較實驗組有明顯潰散，材料不完整。 3.生物力學(xué)測試 單純β-TCP/MCPM和β-TCP/MCPM/FG組骨水泥材料的抗壓強度分別為19.6

10、3±1.98MPa和14.72±1.81MPa。 4.XRD通過與JCPDF標(biāo)準卡片對照，兩種樣品的XRD譜線與標(biāo)準的HAP的XRD譜線一致，其主峰位于XRD譜線32°附近，說明兩種樣品具有相同的結(jié)晶相，加入FG并沒有新的相產(chǎn)生，同純β-CP/MCPM樣品一樣，主要轉(zhuǎn)化為HAP。 5.掃描電鏡觀察掃描電鏡見β-TCP/MCPM由規(guī)則的短棒狀晶體和扁平狀晶體構(gòu)成，晶體互相連接附著，晶體間充滿不規(guī)則的微孔，微孔大小約(2～3

11、um)空隙率約為46.84％。復(fù)合材料內(nèi)FG貫穿于β-TCP/MCPM晶體間，將β-TCP/MCPM晶體緊密連接。晶體間的微孔大小約為(2～5um)空隙率約為48.06％。高溫煅燒后見復(fù)合材料內(nèi)微孔的孔徑較煅燒前有增大，微孔的直徑約為(2～7um)空隙率約為57.58％，且有延伸的溝隙將β-TCP/MCPM微孔相連。 6.全身急性毒性試驗分析：結(jié)果浸提液組小鼠的平均體重在注射后24、48、72h后的變化與生理鹽水組的基本一致，并

12、且小鼠在注射浸提液后也未出現(xiàn)死亡或昏迷、呼吸抑制、呼吸困難、四肢活動受限等中毒反應(yīng)，這表明該復(fù)合人工骨材料沒有急性全身毒性。 7.溶血試驗結(jié)果肉眼下觀察示各實驗組和陰性對照組無明顯溶血，陽性對照組可見有明顯溶血，各實驗組的溶血率均未超過5％，達到標(biāo)準要求。 8.微核試驗各組動物股骨髓嗜多染紅細胞的微核率經(jīng)χ2檢驗，試驗組微核率與陰性對照組差異無顯著性；陰性對照組微核率與陽性對照組差異有顯著性。說明新型復(fù)合人工骨材料的浸提

13、液無細胞遺傳毒性作用。 9.細胞毒性試驗結(jié)果示各實驗組和陰性對照組小鼠MC3T3成骨細胞狀態(tài)生長分化良好，細胞保持梭形，貼壁生長，細胞密度較高，多為長梭形和多角形并見圓形分裂狀態(tài)細胞，陽性對照組細胞出現(xiàn)生長分化停止，細胞變類圓形縮小，出現(xiàn)較多漂浮狀死細胞。酶標(biāo)儀測試各組吸光度值及相對增殖率(RGR)值，各實驗組對MC3T3成骨細胞株的細胞毒性均為I級，對照組為IV～V。 結(jié)論： 1.實驗結(jié)果顯示該復(fù)合材料的具有合

14、適的凝固時間和較好的抗稀散性能；可加速β-CP/MCPM自身的降解，加入纖維蛋白膠后的復(fù)合材料的抗壓強度達到松質(zhì)骨強度的要求，滿足用于非承重骨缺損的充填加入纖維蛋白膠煅燒后CPC的空隙率明顯提高，可見隨著FG的降解，空隙率將逐漸增大，有利于材料的降解，利于新骨的長入，促進骨缺損的修復(fù)。 2.該新型復(fù)合纖維蛋白膠的磷酸鈣人工骨材料具有良好的生物相容性和生物安全性，達到生物相容性和生物安全性要求，基本滿足作為注射型人工骨材料用于臨床