零下非結(jié)冰保存人工肝用永生化肝細(xì)胞.pdf

1、肝功能衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重肝功能損害,現(xiàn)有的病因治療及一般支持治療療效甚微,病死率高達(dá)80％。目前肝移植被認(rèn)為是急慢性肝功能衰竭晚期最有效的治療方法,但是肝移植存在供體嚴(yán)重不足、手術(shù)復(fù)雜風(fēng)險(xiǎn)大、患者需要終身免疫抑制治療及費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn),導(dǎo)致眾多患者在等待供肝期間死亡。而生物人工肝支持系統(tǒng)(Bioatificial liver support system,BLASS)的發(fā)展為肝功能衰竭的治療開辟了新的途徑:一方面部分患者急性肝功能衰

2、竭是可逆的,通過BLASS短期有效的肝功能支持,患者肝臟可望通過殘存的正常肝細(xì)胞代償增生而恢復(fù)功能；另一方面對于不可逆的急慢性肝功能衰竭患者,也可以通過BLASS的體外肝功能支持,為最終的肝移植贏得寶貴的待肝時間,BLASS起到了“肝功能衰竭-肝移植”的橋梁作用。
　　 目前作為BLASS生物材料的體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞需要達(dá)到以下3方面的要求:①質(zhì)量(Quality)要求:肝細(xì)胞應(yīng)具備體內(nèi)肝細(xì)胞清除毒素、生物轉(zhuǎn)化及合成、分泌等主要功

3、能。②數(shù)量(Quantity)要求:肝細(xì)胞數(shù)量至少達(dá)到109個數(shù)量級,才能達(dá)到BLASS的臨床支持要求。③快速臨床應(yīng)用(Ready to use)要求:臨床上各種原因引起的肝功能衰竭患者,往往病情危重,必須短時間內(nèi)獲得大量的肝細(xì)胞用于BLASS體外肝功能支持治療。因此獲得大量功能好的肝細(xì)胞是BLASS的核心,是制約BLASS臨床廣泛應(yīng)用的瓶頸。所以探索出一種實(shí)用可靠的低溫保存體系,建立一個隨時可用的(Ready to use)肝細(xì)胞庫,

4、是BLASS技術(shù)普遍推廣的基礎(chǔ)。
　　 溫度是影響低溫保存效果的關(guān)鍵因素:一般而言溫度越低,細(xì)胞的代謝活性就越低,保存時間就越長。零下非結(jié)冰溫度(Subzero nonfreezing temperature,SZNFT)是指0℃到某溶液冰點(diǎn)之間的溫度范圍,一方面可以使代謝降至最低,不同于常規(guī)低溫保存(4℃及0℃),另一方面可以避免“冰晶形成”、“滲透性休克”等深低溫凍存損傷,理論上SZNFT是一種理想的細(xì)胞保存形式。SZNFT

5、最早用于供肝的保存,使供肝的保存時間明顯延長,但供肝的保存混雜有缺血再灌注損傷的影響,不能完全反應(yīng)對肝細(xì)胞的保存效果。目前SZNFT對永生化肝細(xì)胞的保存效果仍然不明確。因此,本文將在第一部分用UW液SZNFT(-0.8℃)保存L02永生化肝細(xì)胞,同常規(guī)低溫(4℃及0℃)比較,以明確SZNFT保存肝細(xì)胞的效果。
　　 BLASS所用肝細(xì)胞來源至今尚未得到滿意解決。C3A是一種人源性永生化腫瘤細(xì)胞,具有良好的增殖活性及肝細(xì)胞特異功能

6、,如分泌ALB,尿素合成與糖原合成等。L02肝細(xì)胞是國內(nèi)使用正常人肝細(xì)胞篩選出的一種永生化肝細(xì)胞株,具備氨基清除及分泌白蛋白等功能,增殖迅速且傳代穩(wěn)定。有關(guān)C3A與L02肝細(xì)胞SZNFT保存后生物學(xué)特性變化及其差異尚不明確。因此,本研究將在第二部分用UW液SZNFT(-0.8℃)保存C3A與L02肝細(xì)胞,以比較低溫保存后C3A與L02細(xì)胞的生物學(xué)特性變化及其BLASS應(yīng)用傾向性。
　　 UW液(University of Wis

7、consin solution)目前被認(rèn)為是供肝保存的標(biāo)準(zhǔn)液,隨著生物人工肝的發(fā)展,對肝細(xì)胞的需求明顯增加,UW液也被用于肝細(xì)胞的短期低溫保存且效果明顯,但UW液費(fèi)用昂貴,很多成份難以獲得。費(fèi)用較便宜的Celsior液(Celsior solution)和HTK(Histidine-tryptophan-ketoglutarate solution)液也被用于供肝保存的研究,以期待獲得同UW液相同的效果。但UW液、Celsior液和HT

8、K液SZNFT(-0.8℃)保存人源性永生化肝細(xì)胞有無差別未見報(bào)道。因此,本文將在第三部分分別采用UW液、Celsior液和HTK液零下非結(jié)冰保存生物人工肝用L02細(xì)胞72h,以比較其保存效果有無差別并探討其中可能的機(jī)制。
　　 研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是除了壞死之外肝細(xì)胞凍存死亡的一個重要的途徑,但低溫保存引起細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍然不清楚。Bcl-2/Bax蛋白家族是位于線粒體膜上通過調(diào)節(jié)線粒體非滲透性轉(zhuǎn)換孔的開放及細(xì)胞色素C的釋放抑

9、制或者促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展(Bcl-2可通過不同途徑抑制凋亡的發(fā)生,Bax則促進(jìn)凋亡的發(fā)生),因此Bcl-2/Bax比值是衡量細(xì)胞凋亡指數(shù)的一個重要指標(biāo)。目前有關(guān)SZNFT(-0.8℃)保存肝細(xì)胞時Bcl-2/Bax基因及蛋白表達(dá)仍然不明確。因此本文將在第四部分分別采用SZNFT(-0.8℃)、4℃及0℃保存L-02細(xì)胞,以明確Bcl-2/Bax基因和蛋白表達(dá)同低溫保存引起細(xì)胞凋亡的關(guān)系,探索低溫保存引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。
　

10、　 第一部分永生化肝細(xì)胞零下非結(jié)冰保存的效果
　　 目的：
　　 體外培養(yǎng)永生化L02細(xì)胞,制備成細(xì)胞懸液,UW液零下非結(jié)冰(-0.8℃)及常規(guī)低溫(4℃及0℃)分別保存24h、48h及72h,以探索零下非結(jié)冰保存肝細(xì)胞的效果以及同細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液制備:從液氮中取出凍存的L02細(xì)胞,迅速投入37℃水浴箱中,待其完全溶解后轉(zhuǎn)入超凈臺內(nèi)進(jìn)行操作。①嚴(yán)格按照無菌操作

11、方法進(jìn)行,接種到50mL培養(yǎng)瓶。所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F-12,同時添加EGF20ng/ml,胰島素10mg/L,青霉素10kU/L,鏈霉素10g/L,100mL/L的胎牛血清(FBS)。②將培養(yǎng)瓶置于37℃,50mL/LCO2,100％濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。③倒置顯微鏡觀察80％以上細(xì)胞貼壁后換液1次,以后每24h換液1次,直至內(nèi)壁長滿。④取內(nèi)壁長滿的一瓶細(xì)胞,吸除培養(yǎng)液,加0.25％胰酶1mL,于室溫消化1-3min,同時觀察細(xì)胞

12、形態(tài),一旦發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮細(xì)胞間隙增大,即刻吸除胰酶,終止消化。⑤加2mL含10％FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液,用吸管反復(fù)吹打內(nèi)壁,使細(xì)胞完全脫離瓶壁。⑥將同批多瓶L02細(xì)胞懸液混合,取一滴至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,計(jì)算細(xì)胞細(xì)胞密度,最終將細(xì)胞濃度調(diào)至1×109個/L,分裝至2mL凍存管。
　　 2、細(xì)胞低溫保存、分組及復(fù)溫方式:①分裝的2ml凍存管,1000 r/min,離心2min,將含100 mL/L FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)

13、液置換為2 mL UW液,混勻。分別至-0.8℃、0℃及4℃低溫保存,即實(shí)驗(yàn)分為3組:-0.8℃組(零下非結(jié)冰組)、0℃組(零度非結(jié)冰組)及4℃組(對照組),每組18個標(biāo)本。②低溫保存24h、48h及72h后,各組均取6個標(biāo)本,采用快速復(fù)溫法,放入37℃水浴中震蕩1-2min。③復(fù)溫后的標(biāo)本1000r/min,離心2min,將UW液置換為含100 mL/LFBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液2mL,混勻,于37℃,50 mL/L CO2,1

14、00％濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30min。
　　 3、低溫保存復(fù)溫后各指標(biāo)測定概括:(1)取L02細(xì)胞懸液lml,加入到1ml含4mmol/L氯化銨及100 mL/L FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中,于37℃、50 mL/L CO2、100％濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后:①取上清,2000r/min,離心20min,于全自動生化儀測定尿素的濃度、乳酸脫氫酶(LDH)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度。②按照人白蛋白ELISA試劑

15、盒說明,于全自動酶標(biāo)儀測定上清人白蛋白含量。③貼壁細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液后行病理HE染色,觀察細(xì)胞形態(tài)。(2)取L02細(xì)胞懸液0.5ml,按照ATP試劑盒的說明,裂解細(xì)胞后離心,取上清于全自動酶標(biāo)儀測定細(xì)胞內(nèi)ATP含量。①取上清,按照乳酸測定試劑盒的要求,①于分光光度儀測定乳酸含量。(3)取L02細(xì)胞懸液0.5ml,1000r/min,離心2min:沉淀的細(xì)胞按照AnnexinV-FITC凋亡試劑盒要求,于流式細(xì)胞儀定量測定細(xì)胞存活率、凋亡

16、率及壞死率。
　　 4、各溶液降溫曲線及冰點(diǎn)測定:將1ml蒸餾水、UW液和細(xì)胞懸液分別置于2ml凍存管中,將智能溫度計(jì)電極插入溶液中(避免同管壁接觸),然后將凍存管置于-10℃程控低溫培養(yǎng)箱內(nèi),每一分鐘記錄一次溫度值,繪制成時間-溫度曲線[溫度取10℃至(-10)℃]。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同溶液的冰點(diǎn)和零下非結(jié)冰溫度不同:蒸餾水的冰點(diǎn)是0℃；UW液的冰點(diǎn)是-1℃,零下非結(jié)冰溫度是0℃-(-1)℃；L02肝

17、細(xì)胞懸液的冰點(diǎn)為-1℃,零下非結(jié)冰溫度是0℃-(-1)℃。
　　 2、新鮮細(xì)胞存活率為:86.95％±0.58％,隨低溫保存時間延長,各組細(xì)胞存活率呈下降趨勢(P<0.001)。24h,各組細(xì)胞存活率無差異；48h,-0.8℃組細(xì)胞存活率同4℃組相比,開始出現(xiàn)差異；72h,各組細(xì)胞存活率顯著下降,但-0.8℃組細(xì)胞存活率顯著高于0℃組及4℃組(P<0.001)。
　　 3、新鮮細(xì)胞凋亡率為:1.73％±0.20％,隨低溫

18、保存時間延長,各組細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(P<0.001)。24h及48h,各組細(xì)胞凋亡率無差異；72h,各組細(xì)胞凋亡率顯著升高,但-0.8℃組細(xì)胞凋亡率顯著低于0℃組及4℃組(P=0.017)。
　　 4、新鮮細(xì)胞的ALT釋放為:3.83U/L±0.48U/L,LDH釋放為:49.52U/L±5.57U/L。隨低溫保存時間延長,各組細(xì)胞ALT、LDH釋放呈上升趨勢(均P<0.001)。24h各組細(xì)胞ALT、LDH釋放均無差異；4

19、8h,-0.8℃組細(xì)胞ALT、LDH釋放同4℃組相比開始出現(xiàn)差異；72h,各組細(xì)胞ALT、LDH釋放顯著升高,但-0.8℃組細(xì)胞ALT、LDH釋放均顯著低于0℃組及4℃組(均P<0.001)。
　　 5、新鮮細(xì)胞的尿素合成為:2.63mmol/L±0.46mmol/L,隨低溫保存時間延長,各組細(xì)胞尿素合成功能呈下降趨勢(P<0.001)。24h,各組細(xì)胞尿素合成能力無差異；48h,-0.8℃組細(xì)胞尿素合成同4℃組相比開始出現(xiàn)差異

20、；72h,各組細(xì)胞尿素合成能力顯著下降,但-0.8℃組細(xì)胞尿素合成能力顯著強(qiáng)于0℃組及4℃組(P=0.001)。
　　 6、新鮮細(xì)胞的白蛋白分泌為:11.90mg/L±0.39mg/L,隨低溫保存時間延長,各組細(xì)胞白蛋白分泌功能呈下降趨勢(P<0.001)。24h,各組細(xì)胞白蛋白分泌功能無異常；48h,-0.8℃組細(xì)胞白蛋白分泌同4℃組相比,開始出現(xiàn)差異;72h,各組細(xì)胞白蛋白分泌顯著下降,但-0.8℃組細(xì)胞白蛋白分泌功能顯著優(yōu)

21、于0℃組及4℃組(P=0.003)。
　　 7、新鮮細(xì)胞的乳酸釋放:3.48ug/10^6cells±0.81 ug/10^6cells,隨低溫保存時間延長,各組細(xì)胞乳酸釋放呈上升趨勢(P<0.001)。24h,-0.8℃組細(xì)胞乳酸釋放同4℃組相比,開始出現(xiàn)差異各；48h及72h,各組細(xì)胞乳酸釋放顯著升高,但-0.8℃組細(xì)胞乳酸釋放顯著低于0℃組及4℃組(均P<0.001)。
　　 8、新鮮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)ATP含量為:11

22、.29ug/10^6cells±1.66ug/10^6cells,隨低溫保存時間延長,各組細(xì)胞內(nèi)ATP含量呈下降趨勢(P<0.001)。24h,-0.8℃組細(xì)胞內(nèi)ATP含量同4℃組相比,開始出現(xiàn)差異各；48h及72h,各組細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著降低,但-0.8℃組細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著高于0℃組及4℃組(均P<0.001)。
　　 9、新鮮細(xì)胞細(xì)胞膜完好,細(xì)胞漿細(xì)胞核可明顯區(qū)分,死亡細(xì)胞少；低溫保存72h,4℃組及0℃組細(xì)胞較-0.

23、8℃組死亡比例明顯增加,細(xì)胞膜周圍出現(xiàn)“毛刺”樣改變,細(xì)胞內(nèi)可見“空泡樣”改變。
　　 結(jié)論：
　　 1、零下非結(jié)冰保存肝細(xì)胞較常規(guī)低溫可明顯的提高復(fù)溫后細(xì)胞存活率,降低低溫?fù)p傷引起的細(xì)胞凋亡,有效的保護(hù)肝細(xì)胞功能。
　　 2、零下非結(jié)冰保存肝細(xì)胞72h后細(xì)胞存活率仍然可達(dá)70％左右,可作為BLASS用肝細(xì)胞短期低溫保存一種有效的方式。
　　 3、降低細(xì)胞凋亡率是零下非結(jié)冰明顯提高了肝低溫保存后細(xì)胞存活率

24、的重要途徑。
　　 4、采用零下非結(jié)冰保存肝細(xì)胞,建立一個“血庫樣”(Ready to use)的肝細(xì)胞庫,可能會有效的促進(jìn)BLASS的發(fā)展。
　　 第二部分零下非結(jié)冰保存C3A與L02肝細(xì)胞后的生物學(xué)特性比較
　　 目的：
　　 比較UW液零下非結(jié)冰(-0.8℃)保存后C3A與L-02細(xì)胞的生物學(xué)特性變化及其差異,探索其對生物人工肝的應(yīng)用傾向。
　　 方法：
　　 具體方法詳見第一部分。

25、
　　 結(jié)果：
　　 1、隨低溫保存時間的延長,C3A細(xì)胞與L02細(xì)胞存活率呈下降趨勢(P<0.001)；新鮮細(xì)胞及各低溫保存時間點(diǎn)24h,48h及72h,C3A細(xì)胞存活率均高于L02細(xì)胞且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.001)。
　　 2、隨低溫保存時間的延長,C3A細(xì)胞與L02細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(P<0.001)；新鮮細(xì)胞及各低溫保存時間點(diǎn)24h,48h及72h,C3A細(xì)胞凋亡率均低于L02細(xì)胞且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均

26、P≤0.005)。
　　 3、隨低溫保存時間的延長,C3A細(xì)胞與L02細(xì)胞ALT釋放呈上升趨勢(P<0.001)；新鮮細(xì)胞及各低溫保存時間點(diǎn)24h,48h及72h,C3A細(xì)胞ALT釋放均低于L02細(xì)胞且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P≤0.011)。
　　 4、隨低溫保存時間的延長,C3A細(xì)胞與L02細(xì)胞LDH釋放呈上升趨勢(P<0.001)；新鮮細(xì)胞及各低溫保存時間點(diǎn)24h,48h及72h,C3A細(xì)胞LDH釋放均低于L02細(xì)胞且有統(tǒng)

27、計(jì)學(xué)差異(均P≤0.001)。
　　 5、隨低溫保存時間的延長,C3A細(xì)胞與L02細(xì)胞尿素合成呈下降趨勢(P<0.001)；新鮮細(xì)胞及各低溫保存時間點(diǎn)24h,48h及72h,C3A細(xì)胞尿素合成均低于L02細(xì)胞且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P≤0.002)。
　　 6、隨低溫保存時間的延長,C3A細(xì)胞與L02細(xì)胞白蛋白分泌呈下降趨勢(P<0.001)；新鮮細(xì)胞及各低溫保存時間點(diǎn)24h,48h及72h,C3A細(xì)胞白蛋白分泌均高于L02細(xì)

28、胞且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1、低溫保存后C3A細(xì)胞的存活率、凋亡率、ALT及LDH釋放、白蛋白分泌均優(yōu)于L02細(xì)胞。
　　 2、低溫保存后L02細(xì)胞的尿素合成功能優(yōu)于C3A細(xì)胞。
　　 3、以L02細(xì)胞為材料的BLASS可能更適用于肝功能衰竭合并肝性腦病。
　　 4、以C3A細(xì)胞為材料的BLASS可能更適用于肝功能衰竭合并低白蛋白血癥。
　　 第三部分 U

29、W液、Celsior液和HTK液零下非結(jié)冰保存肝細(xì)胞的效果比較
　　 目的：
　　 體外培養(yǎng)永生化L02細(xì)胞,制備成細(xì)胞懸液,分別采用UW液、Celsior液和HTK液零下非結(jié)冰(-0.8℃)保存72h,以比較其保存效果有無差別并探討其中可能的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):從液氮中取出凍存的L02細(xì)胞,迅速投入37℃水浴箱中,待其完全溶解后轉(zhuǎn)入超凈臺內(nèi)進(jìn)行操作。①嚴(yán)格按照無菌操作方法進(jìn)行,接種

30、到50mL培養(yǎng)瓶。所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F-12,同時添加EGF20ng/ml,胰島素10mg/L,青霉素10kU/L,鏈霉素10g/L,100mL/L的胎牛血清(FBS)。②將培養(yǎng)瓶置于37℃,50mL/LCO2,100％濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。③倒置顯微鏡觀察80％以上細(xì)胞貼壁后換液1次,以后每24h換液1次,直至內(nèi)壁長滿。
　　 2、細(xì)胞低溫保存、分組及復(fù)溫方式:①移除培養(yǎng)基,PBS液洗滌細(xì)胞3次后分別置換為UW液、Cel

31、sior液及HTK液5ml,-0.8℃低溫保存72h,即實(shí)驗(yàn)分為3組:UW液組、Celsior液組及HTK液組,每組6個標(biāo)本。②低溫保存72h后,各組樣本均分別移除UW液、Celsior液及HTK液,PBS洗滌細(xì)胞3次后置換為5ml的培養(yǎng)液,于37℃,50 mL/L CO2,100％濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30min。
　　 3、細(xì)胞懸液的制備:①取內(nèi)壁長滿的一瓶細(xì)胞,吸除培養(yǎng)液,加0.25％胰酶1mL,于室溫消化1-3min,同時觀

32、察細(xì)胞形態(tài),一旦發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮細(xì)胞間隙增大,即刻吸除胰酶,終止消化。②加2mL含10％FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液,用吸管反復(fù)吹打內(nèi)壁,使細(xì)胞完全脫離瓶壁成細(xì)胞懸液。③取一滴至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,計(jì)算細(xì)胞細(xì)胞密度,最終將細(xì)胞濃度調(diào)至1×109個/L。
　　 4、低溫保存復(fù)溫后各指標(biāo)測定概括:(1)取L02細(xì)胞懸液1ml,加入到1ml含4mmol/L氯化銨及100 mL/L FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中,于37℃、5

33、0 mL/L CO2、100％濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后:①取上清,2000r/min,離心20min,于全自動生化儀測定尿素的濃度(氯化銨轉(zhuǎn)化試驗(yàn))、乳酸脫氫酶(LDH)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度。②按照人白蛋白ELISA試劑盒說明,于全自動酶標(biāo)儀測定上清人白蛋白含量。(2)取L02細(xì)胞懸液1ml,按照Live/Dead試劑盒要求,于流式細(xì)胞儀定量測定細(xì)胞存活率、死亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1、新鮮細(xì)胞的存活率是89

34、.33％±2.64％,死亡率是10.08％±2.56％。低溫保存72h后,各組細(xì)胞存活率較新鮮細(xì)胞降低,但UW液組細(xì)胞存活率顯著高于Celsior液組和HTK液組(P<0.001)；細(xì)胞死亡率較新鮮細(xì)胞增加,但UW液組細(xì)胞死亡率顯著低于Celsior液組和HTK液組(P<0.001),
　　 2、新鮮細(xì)胞釋放的ALT是3.93 U/L±1.04U/L,LDH是44.00U/L±5.72U/L。低溫保存72h后,細(xì)胞ALT釋放及L

35、DH釋放較新鮮細(xì)胞增加,但UW液組ALT及LDH釋放均顯著低于HTK液組(均P≤0.010)；ALT釋放UW液組同Celsior液組無差異(P=0.070),而LDH則有差異(P=0.004)。
　　 3、新鮮細(xì)胞尿素合成是2.60 mmol/L±0.56mmol/L,白蛋白分泌是12.21mg/L±1.68mg/L。低溫保存72h后,細(xì)胞尿素合成功能下降,但UW液組尿素合成功能優(yōu)于HTK液組(P=0.002),同Celsior

36、液組無差別(P=0.358)；細(xì)胞白蛋白分泌功能下降,但UW液組白蛋白分泌優(yōu)于Celsior液組與HTK液組(P=0.015),Celsior液組與HTK液組無差別(P=0.618)。
　　 結(jié)論：
　　 1、零下非結(jié)冰UW液保存肝細(xì)胞存活率明顯優(yōu)于Celsior液和HTK液,HTK液細(xì)胞存活率最低。
　　 2、UW液與Celsior液維持肝細(xì)胞的尿素合成功能無差異,但優(yōu)于HTK液。
　　 3、Celsi

37、or液和HTK液維持肝細(xì)胞白蛋白分泌功能無差異,但不及UW液。
　　 4、UW液零下非結(jié)冰保存肝細(xì)胞不宜超過72h,某些情況下可用Celsior液替代UW液
　　 第四部分零下非結(jié)冰保存時肝細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究
　　 目的：
　　 凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax比值是衡量細(xì)胞凋亡指數(shù)的一個重要指標(biāo)。目前有關(guān)SZNFT保存肝細(xì)胞時Bcl-2/Bax基因及蛋白表達(dá)仍然不明確。因此本文分別采用SZNFT(-0.8

38、℃)、4℃及0℃保存L02細(xì)胞,以明確Bcl-2/Bax基因和蛋白表達(dá)同低溫保存引起細(xì)胞凋亡的關(guān)系,探索低溫保存引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、具體實(shí)驗(yàn)方法詳見第三部分。
　　 2、低溫保存復(fù)溫后各指標(biāo)測定概括:(1)取L02細(xì)胞懸液1ml,①取上清,2000r/min,離心20min,于全自動生化儀測定乳酸脫氫酶(LDH)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度,沉淀細(xì)胞按照AnnexinV-FITC凋亡試

39、劑盒測定細(xì)胞存活率、凋亡率。(2)取細(xì)胞懸液1ml,1000r/min,離心2min,沉淀細(xì)胞按TotalRNA提取試劑盒(NPK201,Toyobo)要求及一步法Realtime-PCR試劑盒(QRT201,Toyobo)要求于定量PCR儀測定Bcl-2/Bax目的基因mRNA及β-actin基因mRNA的定量表達(dá)。(3)取細(xì)胞懸液1ml,1000r/min,離心2min,沉淀細(xì)胞按蛋白抽提試劑盒提取蛋白,Western Blot測定

40、Bcl-2/Bax蛋白及β-actin蛋白的定量表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、新鮮細(xì)胞的存活率是87.35％±1.97％,凋亡率是1.73％±0.26％。低溫保存72h后,各組細(xì)胞存活率較新鮮細(xì)胞降低,但-0.8℃組細(xì)胞存活率顯著高于0℃組和4℃組(P<0.001)；細(xì)胞凋亡率較新鮮細(xì)胞增加,但UW液組細(xì)胞凋亡率顯著低于0℃組和4℃組(P=0.019)。
　　 2、新鮮細(xì)胞釋放的ALT是3.78 U/L±0.4

41、8U/L,LDH是39.48 U/L±5.72U/L。低溫保存72h后,細(xì)胞ALT釋放及LDH釋放較新鮮細(xì)胞增加,但-0.8℃組ALT及LDH釋放均顯著低于4℃組(均P≤0.001);ALT釋放0℃組同-0.8℃組無差異(P=0.088),而LDH則有差異(P=0.002)。
　　 3、新鮮細(xì)胞及各組細(xì)胞所提Total RNA采用分光光度儀測定,A260/A280的光密度OD值均在1.8～2.0之間,采用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳

42、可見清晰的三條RNA條帶:28S、18S、5S,說明RNA質(zhì)量良好可以進(jìn)行Realtime-PCR擴(kuò)增。
　　 4、以β-actin為內(nèi)參,分別計(jì)算新鮮細(xì)胞和各組細(xì)胞的Bcl-2-mRNA和Bax-mRNA的定量表達(dá)。新鮮細(xì)胞Bcl-2-mRNA和Bax-mRNA呈基礎(chǔ)表達(dá)。低溫保存72h后各組Bcl-2-mRNA表達(dá)下降,但-0.8℃組顯著高于0℃組及4℃組(P<0.001),0℃組及4℃組Bcl-2-mRNA表達(dá)無差異(P=

43、0.387)；Bax-mRNA表達(dá)則相反,-0.8℃組顯著低于0℃組及4℃組(P<0.001),且0℃組及4℃組無差異(P=0.432)；-0.8℃組Bcl-2/Bax比值顯著高于0℃組及4℃組(P<0.001)。
　　 5、以β-actin為內(nèi)參,Western blot測定新鮮細(xì)胞和各組細(xì)胞的Bcl-2蛋白和Bax蛋白的定量表達(dá)。新鮮細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白呈基礎(chǔ)表達(dá)。低溫保存72h后,-0.8℃組Bcl-2蛋白顯著高于0

44、℃組及4℃組(P<0.001),0℃組及4℃組Bcl-2蛋白表達(dá)無差異(P=0.300)；Bax蛋白則相反,-0.8℃組Bax蛋白顯著低0℃組及4℃組(P=0.006)。-0.8℃組Bcl-2/Bax比值顯著高于0℃組及4℃組(P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1、UW液零下非結(jié)冰保存肝細(xì)胞較常規(guī)低溫(0℃及4℃)明顯降低了細(xì)胞凋亡率。
　　 2、線粒體途徑相關(guān)的細(xì)胞凋亡可能在肝細(xì)胞低溫保存損傷中發(fā)揮了重要