新生實驗小型豬肝細胞用于生物人工肝的基礎(chǔ)實驗研究.pdf

1、肝細胞是生物人工肝(Bioartificialliver，BAL)的核心材料，BAL對肝功能衰竭患者的肝支持作用幾乎完全依賴于所用肝細胞的生物學功能。由于人肝細胞來源的匱乏、胎肝細胞的倫理問題、肝細胞株的瘤源性等原因，使豬肝細胞成為BAL研究和應用最多的細胞，成功的臨床報道愈來愈多，并已進入Ⅱ/Ⅲ期臨床研究。但有關(guān)BAL系統(tǒng)中肝細胞材料、物質(zhì)交換以及肝細胞的保存和運輸?shù)确矫嬉廊淮嬖谥T多尚未徹底解決的問題。 本實驗觀察原代培養(yǎng)乳豬

2、肝細胞的生長增殖特性，檢測乳豬肝細胞的合成功能和生物轉(zhuǎn)化功能，以評價乳豬肝細胞是否適用于BAL；使用體外循環(huán)細胞懸液的方法，觀察循環(huán)狀態(tài)下乳豬肝細胞形態(tài)和功能的變化，為解決物質(zhì)交換而構(gòu)建雙向循環(huán)系統(tǒng)提供實驗依據(jù)；采用亞低溫培養(yǎng)乳豬肝細胞，觀察復溫前后肝細胞形態(tài)和功能的變化，評價亞低溫和亞低溫培養(yǎng)時間對肝細胞的影響，為BAL探索一種方便有效的肝細胞保存和運輸方法。 實驗方法和結(jié)果如下：1.采用RPMI-1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)乳豬肝

3、細胞，觀察肝細胞形態(tài)和數(shù)量的變化，檢測乳豬肝細胞白蛋白合成、尿素合成、氯化銨清除、7-甲氧基-試鹵靈和P-硝基苯酚轉(zhuǎn)化情況，并與胎肝細胞進行對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的乳豬肝細胞可增殖7倍以上，其生長曲線有明顯的對數(shù)生長期和停滯期，未見明顯的潛伏期。培養(yǎng)過程中，乳豬肝細胞尿素合成率、氨清除率、細胞色素P450系統(tǒng)(CytchromeP450，CYP)活性顯著高于胎肝細胞，以及較高的尿苷二磷酸葡萄醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronyl

4、transgerases，UGT)活性，提示乳豬肝細胞具有較強的增殖能力和較好的合成功能、生物轉(zhuǎn)化功能。 2.利用Cello培養(yǎng)循環(huán)式人工毛細管培養(yǎng)裝置構(gòu)建肝細胞循環(huán)系統(tǒng)，以50ml/min的流速循環(huán)乳豬肝細胞懸液，分別觀察循環(huán)狀態(tài)下肝細胞形態(tài)、活力、功能等的變化。結(jié)果顯示：循環(huán)4h后，乳豬肝細胞的活力和貼壁率下降，分別為76.1±1.4％、62.8±1.8％，氨清除率是對照組的62.7±14.6％，提示循環(huán)4h后肝細胞仍具有一

5、定的活力和功能。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著循環(huán)時間的延長，細胞碎片增多，LDH和AST顯著升高，細胞活力、貼壁率、白蛋白和尿素合成率、氨清除率顯著下降，表明長時間循環(huán)對肝細胞有較大的損傷。 3.將新分離的乳豬肝細胞37℃培養(yǎng)4h后，分別轉(zhuǎn)入25℃、28℃、33℃等溫度下培養(yǎng)24h，再恢復37℃培養(yǎng)，觀察復溫前后肝細胞形態(tài)、生長特性、活力和功能的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞低溫培養(yǎng)24h，乳豬肝細胞未見明顯增殖，細胞活力、功能均有不同程度的降低。但

6、復溫后肝細胞迅速增殖，細胞活力和功能較復溫前顯著升高，其中28℃和33℃培養(yǎng)肝細胞復溫后的活力和功能顯著高于25℃培養(yǎng)肝細胞的活力和功能。進一步將肝細胞置28℃分別培養(yǎng)24h、48h、72h，復溫后的肝細胞形態(tài)和功能無顯著差異。上述結(jié)果提示亞低溫抑制肝細胞的增殖和功能，復溫后肝細胞能恢復細胞的增殖能力和功能，肝細胞在28℃亞低溫下能夠較穩(wěn)定地保存72h,可以解決肝細胞從實驗室或生產(chǎn)單位運輸?shù)脚R床應用的時間問題。 以上結(jié)果表明：1