亞洲帶絳蟲實(shí)驗(yàn)感染乳豬肝細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的研究.pdf

1、目的：
　　1.探索亞洲帶絳蟲實(shí)驗(yàn)感染乳豬后不同時(shí)間囊尾蚴寄生處肝細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的變化，以及亞洲帶絳蟲感染乳豬所致肝細(xì)胞活力的變化，為闡明亞洲帶絳蟲感染所致中間宿主肝損傷的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)資料。
　　2.了解MAPK特異性抑制劑干預(yù)后亞洲帶絳蟲感染早期乳豬肝細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的變化，探究MAPK特異性抑制劑是否能夠減輕亞洲帶絳蟲所致肝組織損傷，進(jìn)一步為抗囊尾蚴病的藥物研發(fā)及

2、囊尾蚴病的治療提供新的、有價(jià)值的基礎(chǔ)資料。
　　方法：
　　1.從貴州省都勻市墨沖鎮(zhèn)采用檳榔-南瓜子法對(duì)患者進(jìn)行驅(qū)蟲治療，收集帶絳蟲成蟲標(biāo)本。觀察蟲體一般形態(tài)學(xué)特征，并提取孕節(jié)DNA進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以確定采集的蟲體為亞洲帶絳蟲。
　　2.從亞洲帶絳蟲成蟲孕節(jié)分離蟲卵，離心沉淀收集蟲卵懸液。20日齡約克二元施格雜交乳豬50頭，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組36頭（感染組15頭和抑制劑干預(yù)組21頭）和正常對(duì)照組14頭，兩實(shí)驗(yàn)組均以定量

3、蟲卵15萬(wàn)個(gè)/頭灌胃感染，抑制劑干預(yù)組自灌胃之日起每頭乳豬分別腹腔注射抑制劑U0126、SB203580和SP6001251mg/kg，隔天一次，連續(xù)注射7次。于感染后第15、45和75天麻醉處死各組乳豬4～7頭，以獲得各組乳豬肝臟。
　　3.用cck-8法檢測(cè)各組肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組乳豬肝細(xì)胞的ERK1、p38和JNK1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量；并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組乳豬肝細(xì)胞的凋亡率。采用方差分析對(duì)數(shù)

4、據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.采集的4條帶絳蟲呈乳白色，長(zhǎng)1.55～3.65m，節(jié)片數(shù)為562～877節(jié)，節(jié)片較薄。經(jīng)醋酸明礬卡紅染色見(jiàn)蟲體頭節(jié)近方形，有4個(gè)吸盤，無(wú)頂突和小鉤，成節(jié)卵巢為2葉，孕節(jié)子宮每側(cè)分支數(shù)為16～25支。帶絳蟲提取的DNA經(jīng)亞洲帶絳蟲cox1基因片段的特異性引物PCR，均擴(kuò)增出260bp的產(chǎn)物。根據(jù)一般形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，證實(shí)4條墨沖鎮(zhèn)采集的帶絳蟲為亞洲帶絳蟲。
　　2.實(shí)

5、驗(yàn)組36頭乳豬均感染上亞洲帶絳蟲囊尾蚴，感染率為100％。囊尾蚴只存在于乳豬肝臟，其它組織未檢獲。
　　3.
　?。?)cck-8法檢測(cè)各組肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：感染后第15、45和75天，感染組肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為（23.11±1.26）%、（25.15±1.26）%和（20.72±1.3）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。感染后第15天，U0126干預(yù)組、SB203580干預(yù)組和 SP600125干預(yù)組的肝細(xì)胞生長(zhǎng)

6、抑制率分別是（12.59±1.2）%、（16.48±0.7）%、（18.3±0.75）%，均較感染組明顯下降（P<0.05）。
　?。?）流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組肝細(xì)胞凋亡率：感染后第15天，感染組和抑制劑干預(yù)組的肝細(xì)胞凋亡率均較正常對(duì)照組明顯增高（P<0.05），U0126干預(yù)組肝細(xì)胞凋亡率較感染組明顯增高（P<0.05），SB203580和SP600125干預(yù)組肝細(xì)胞凋亡率均較感染組降低（P<0.05）。感染后第75和45天感染組的

7、肝細(xì)胞凋亡率均較感染后第15天明顯增高（P<0.05），且感染后第75天感染組的肝細(xì)胞凋亡率明顯高于感染后45天（P<0.05）。
　?。?）熒光定量PCR檢測(cè)各組肝細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量：感染后第15、45和75天，感染組的ERK1和p38 mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組上調(diào)，而JNK1 mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組下調(diào)，隨感染時(shí)間延長(zhǎng)ERK1和p38 mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P<0.05）。感染后第15

8、天，U0126干預(yù)組的ERK1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)（P<0.05）；SB203580干預(yù)組的p38 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)（P<0.05），但SB203580干預(yù)組較感染組明顯下調(diào)（P<0.05）；SP600125干預(yù)組的JNK1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下調(diào)（P<0.05），且SP600125干預(yù)組較感染組明顯下調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了亞洲帶絳蟲感染和 MAPK特異性