EV71感染樹突狀細(xì)胞MAPK信號(hào)通路分子差異表達(dá)研究.pdf

1、目的：篩選樹突狀細(xì)胞（DCs）感染腸道病毒71型（EV71）前后絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路分子基因差異表達(dá)，闡明MAPK信號(hào)通路在EV71感染中的作用及效應(yīng)機(jī)制，為預(yù)防和治療EV71感染提供新的策略。
　　方法：(1)密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁2小時(shí)后去除懸浮細(xì)胞，加入含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基、重組人粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、重組人白細(xì)胞介素-4(IL-4)

2、的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)6天，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表型，獲得未成熟 DCs；隨后用 EV71感染未成熟 DCs，并檢測(cè)感染后 DCs表型。（2）采用 qRT-PCR方法分別檢測(cè) EV71感染前和感染2h及8h后 DCs中MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)情況。（3）Western Blot檢測(cè)MEK/ERK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平及EV71/VP1的表達(dá)量。
　　結(jié)果：（1）流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)第6天DCs表型，CD11c，HLA-DR表

3、達(dá)率高達(dá)90%以上，CD80、CD86達(dá)60%以上，CD83表達(dá)率為19.9%，淋巴細(xì)胞型CD3低表達(dá)，是未成熟DCs的標(biāo)志。EV71感染后DCs CD11c、HLA-DR依舊高表達(dá)，CD83、CD86表達(dá)較未感染DCs表達(dá)率高。（2）RT-PCR結(jié)果顯示EV71感染DCs后IκB-α、IKKβ、IL-1α、IL-12、JUN、Fos、NF-ΚB1等基因表達(dá)明顯上調(diào)；而MAP2K1、MAP2K2、MAPK1和MAPK3的mRNA表達(dá)量并

4、未見明顯變化。（3） Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白MEK1/2和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun在EV71感染8h后磷酸化水平增高，ERK1/2在2h、8h和20h后分別呈現(xiàn)出增高、降低再增高的雙相激活趨勢(shì)。NF-κB蛋白磷酸化水平及EV71 VP1蛋白表達(dá)量隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而增加。
　　結(jié)論：EV71感染DCs后，可明顯刺激DCs的成熟并雙相激活MEK/ERK信號(hào)通路，以上結(jié)果說明MEK/ERK信號(hào)通路的激活