人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因促進(jìn)大鼠缺血后肢血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多階段、多平面——難治性下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥是血管外科治療的難點(diǎn)。由于缺乏理想的遠(yuǎn)端流出道，使血管搭橋、腔內(nèi)血管成形等常規(guī)血管外科技術(shù)難以有效實(shí)施；藥物治療也未取得突破性進(jìn)展。最終相當(dāng)一批患者由于嚴(yán)重缺血導(dǎo)致的靜息痛、難以愈合的潰瘍感染和壞疽，不得不選擇截肢，甚至約10％的截肢患者一段時(shí)間后還得考慮二次高位截肢。積極尋求治療難治性動(dòng)脈硬化閉塞癥的新策略是當(dāng)前迫切需要解決的重大的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。 目前認(rèn)為下肢動(dòng)脈缺血的病理學(xué)原因是缺血肢體

2、的主要?jiǎng)用}閉塞，遠(yuǎn)端肢體的血供基本依靠側(cè)支循環(huán)，當(dāng)自發(fā)性的側(cè)支循環(huán)血供不能滿(mǎn)足組織灌注時(shí)，缺血隨即發(fā)生。分子生物學(xué)和分子病理學(xué)的發(fā)展使血管發(fā)生的分子機(jī)制部分被闡明，細(xì)胞因子被認(rèn)為起著重要的始動(dòng)和維持作用?！爸委熜匝苄律钡睦砟钜矐?yīng)運(yùn)而生，既向阻塞動(dòng)脈近段轉(zhuǎn)染具有血管再生作用的生長(zhǎng)因子或相應(yīng)基因，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成大量新生血管，跨越阻塞動(dòng)脈段，建立豐富側(cè)支循環(huán)，以改善缺血組織的血供。第一個(gè)用于促血管新生的因子是VEGF家族成員和

3、FGF家族成員，已知腺病毒介導(dǎo)VEGF165，VEGF121和FGF4基因轉(zhuǎn)染治療缺血性心血管疾病已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一種間質(zhì)來(lái)源的多效性因子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)，從而HGF在這些組織中以旁分泌形式顯示增殖、遷移、形態(tài)形成、再生以及凋亡抑制等多種多樣的生物活性作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)HGF同樣具有強(qiáng)烈的促血管生成作用，與VEGF相比其特點(diǎn)表現(xiàn)為：1.在血管組織中對(duì)內(nèi)

4、皮細(xì)胞有相對(duì)特異性，促進(jìn)其增殖、遷移，但對(duì)血管平滑肌細(xì)胞僅促進(jìn)遷移而不引起增殖；2.促內(nèi)皮細(xì)胞分裂活性在體內(nèi)、外均較VEGF強(qiáng)；3.HGF在缺血組織中表達(dá)明顯減少而其特異性受體C-met則被上調(diào)；4.對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有抗凋亡活性；5.HGF可升高基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)水平和uPA活性；6.其直接促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和間接的刺激血管平滑肌細(xì)胞生成VEGF的雙重促血管生成機(jī)制似乎比VEGF有更明顯的療效；7.并且HGF沒(méi)有血管通透性這一副作用等這

5、些性質(zhì)使其臨床應(yīng)用前景更加廣闊。 近來(lái)日本學(xué)者通過(guò)將裸HGF質(zhì)粒直接注射到動(dòng)脈缺血肢體骨骼肌中的方法，成功完成了HGF基因治療動(dòng)脈缺血肢體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，效果喜人。國(guó)內(nèi)已見(jiàn)少量報(bào)道，但不完善。本研究構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染從體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察了對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生的作用。本研究分三個(gè)部分，分述如下： 第一部分pEGFP-HGF-C1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建目的：獲取人HGFcDNA，

6、構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。 方法：酶切pCMV-HGF，獲得人HGFcDNA全長(zhǎng)并鑒定；將其插入以CMV為啟動(dòng)子、GFP為報(bào)告基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，擴(kuò)增后挑取插入方向正確的克隆，最后測(cè)序鑒定。 結(jié)果：酶切所得HGFcDNA經(jīng)測(cè)序鑒定為人胎盤(pán)HGFcDNA全長(zhǎng)序列的-27～2246處堿基；插入載體pEGFP-C1中，擴(kuò)增后挑取陽(yáng)性菌落；PCR法鑒定獲得正向表達(dá)HGF的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1，測(cè)

7、序無(wú)誤，構(gòu)建成功。 第二部分HGF基因促進(jìn)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的體外研究目的：觀察質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1轉(zhuǎn)染大鼠骨骼肌細(xì)胞后，上清液中表達(dá)的HGF對(duì)ECs的作用。 方法：胰酶消化法建立大鼠原代骨骼肌細(xì)胞，差速貼壁法純化，經(jīng)Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)法和電鏡法鑒定；貼塊法建立大鼠原代血管內(nèi)皮細(xì)胞，八因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定；使用脂質(zhì)體向骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率；ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液

8、中HGF表達(dá)濃度；MTT比色法測(cè)定HGF對(duì)ECs促增殖作用。 結(jié)果：通過(guò)胰酶消化法建立了大鼠原代骨骼肌細(xì)胞，傳代時(shí)以差速貼壁法純化，使骨骼肌細(xì)胞純度達(dá)到80％，細(xì)胞融合分化后可見(jiàn)肌管形成，經(jīng)骨骼肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)法和電鏡法鑒定，證明培養(yǎng)的細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞，取2-4代做實(shí)驗(yàn)用；通過(guò)貼塊法建立了大鼠原代血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞融合可見(jiàn)典型的“鋪路石”樣表現(xiàn)，經(jīng)八因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定，證明培養(yǎng)的細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞

9、，并取2-4代做實(shí)驗(yàn)用；優(yōu)化條件后，使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000以質(zhì)粒：脂質(zhì)體為1μg：1.5μl向骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1，以GFP熒光表達(dá)間接代表HGF表達(dá)，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率為0.8％；ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中HGF濃度，第1天HGF表達(dá)656.3±170.5pg/ml，第4天達(dá)到高峰為5402.0±227.9pg/ml，并至少持續(xù)到轉(zhuǎn)染后的第9天575.1±146.3pg/ml，空載和空

10、白對(duì)照組沒(méi)有測(cè)出；用0.25ng/ml、0.50ng/ml、1.00ng/ml、2.00ng/ml四種不同濃度的HGF及空載和空白對(duì)照組細(xì)胞上清液處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后，使用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率，結(jié)果表明HGF對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞具有促增殖作用，同對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，這種促增殖作用具有量效和時(shí)效關(guān)系，濃度應(yīng)在1.00ng/ml以上，作用時(shí)間為3天。 第三部分HGF基因治療促進(jìn)大鼠缺血后肢血管新生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

11、：觀察質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1對(duì)大鼠急性缺血肢體血管新生的作用 方法：建立大鼠急性缺血肢體模型；裸質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1200μg/500μ1直接注射缺血肢體肌肉，術(shù)后3、6、9天取標(biāo)本行HGF免疫組織化學(xué)和蛋白印跡檢測(cè)；術(shù)后24天取標(biāo)本行血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31免疫組化檢測(cè)，估算毛細(xì)血管密度，以評(píng)價(jià)血管新生情況。 結(jié)果：蛋白印跡HGF表達(dá)灰度比結(jié)果顯示治療組于3、6、9天分別是5.52±0.70、2.37±

12、0.36、3.53±0.43，同空載和空白對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)；免疫組化HGF表達(dá)面密度結(jié)果顯示治療組于3、6、9天分別是0.386±0.037、0.318±0.043、0.286±0.044，同空載和空白對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)；術(shù)后24天治療組、空載組、空白組毛細(xì)血管密度(個(gè)/200倍視野)分別為10.81±2.35、6.11±0.90、5.45±0.90，治療組明顯增高，差異有顯著性(P＜0.01)

13、。 總之，通過(guò)以上三部分實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論：1.作為本實(shí)驗(yàn)的基因治療載體工具，pEGFP-HGF-C1在真核細(xì)胞中表達(dá)HGF-GFP融合蛋白，在熒光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，可作為目的基因表達(dá)的間接證據(jù)。 2.質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染大鼠骨骼肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)0.8％，表達(dá)HGF可持續(xù)9天以上，1.5×105細(xì)胞最高峰(第4天)可產(chǎn)生2.7ng的HGF。 3.基因轉(zhuǎn)染后骨骼肌細(xì)胞分泌的HGF

14、對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞有促增殖作用，說(shuō)明HGF-GFP融合蛋白有功能，且具有量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系，作用濃度應(yīng)在1.00ng/ml以上，作用時(shí)間為3天。 4.裸質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1直接注射到大鼠急性缺血肢體肌肉中，可被缺血骨骼肌細(xì)胞攝取且目的基因HGF得到表達(dá)，并可持續(xù)9天以上，但隨時(shí)間的推移有下降的趨勢(shì)。 5.在術(shù)后24天的缺血肌肉組織中，治療組的毛細(xì)血管密度明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明了質(zhì)粒pEGFP-HGF-C1轉(zhuǎn)染缺血肌