用雜交瘤技術(shù)建立永生化肝細(xì)胞研究藥物代謝.pdf

1、研究背景：原代肝細(xì)胞由于包含幾乎肝臟所有的藥物代謝酶及相應(yīng)輔助因子，代謝功能與體內(nèi)肝細(xì)胞相似，一直是體外藥物代謝研究推崇的經(jīng)典模型。但原代肝細(xì)胞體外分離培養(yǎng)條件復(fù)雜、藥物代謝酶活性維持時(shí)間短、不能傳代培養(yǎng)長(zhǎng)期使用等弊端，導(dǎo)致原代肝細(xì)胞的應(yīng)用成本較高、缺乏靈活性。因此，藥物代謝研究領(lǐng)域迫切需要建立原代肝細(xì)胞的理想替代模型。 研究目的：選擇適宜種屬和組織起源的腫瘤細(xì)胞株，采用雜交瘤技術(shù)將其與原代肝細(xì)胞融合，建立既具有原代肝細(xì)胞正常藥

2、物代謝活性，又具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖能力，可體外長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代利用的永生化肝細(xì)胞(肝雜交瘤細(xì)胞株)。 研究?jī)?nèi)容：分離、培養(yǎng)、凍存具備良好藥物代謝活性的大鼠原代肝細(xì)胞；誘變篩選不同種屬及組織起源的HGPRT基因缺陷(HGPRT)型腫瘤細(xì)胞株作為親本瘤細(xì)胞的考察；利用雜交瘤技術(shù)將原代肝細(xì)胞與不同親本瘤細(xì)胞株融合，建立符合藥物代謂研究要求、具備良好藥物代謝酶活性的肝雜交瘤細(xì)胞株，并對(duì)其生物學(xué)特性及功能進(jìn)行鑒定；評(píng)價(jià)肝雜交瘤細(xì)胞株在體外藥物

3、代謝研究中的應(yīng)用價(jià)值。 技術(shù)方法：改進(jìn)膠原酶二步灌流法分離培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞；化學(xué)誘變劑誘變、細(xì)胞克隆化培養(yǎng)、HAT篩選鑒定HGPRT型腫瘤細(xì)胞株；PEG化學(xué)融合法進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)；相關(guān)的細(xì)胞功能檢測(cè)和鑒定綜合采用形態(tài)學(xué)觀察、HAT篩選、染色體核型分析、雙熒光標(biāo)記共聚焦激光掃描檢測(cè)以及特征性生化指標(biāo)包括糖原合成、白蛋白分泌和尿素合成功能的測(cè)定；細(xì)胞的藥物代謝活性評(píng)價(jià)采用底物孵育法，HPLC和LC-MS技術(shù)檢測(cè)。 結(jié)果：優(yōu)

4、化建立了大鼠原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，所得原代肝細(xì)胞保持分泌白蛋白、合成尿素和糖原等肝細(xì)胞特征生物合成功能，具備全面良好的450酶代謝活性；克隆篩選了HAT敏感的HGPRT型人SMMC-7721肝癌細(xì)胞、小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞和大鼠H4TG肝癌細(xì)胞3株不同種屬和組織起源的腫瘤細(xì)胞作為親本瘤細(xì)胞進(jìn)行與原代肝細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)考察，得到的3株不同融合細(xì)胞表現(xiàn)出不同的培養(yǎng)特性。肝-7721雜交瘤細(xì)胞和肝-H4TG雜交瘤細(xì)胞能長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)且具備藥

5、物代謝活性。其中肝-H4TG雜交瘤細(xì)胞株在長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代過(guò)程中表現(xiàn)出較好的形態(tài)學(xué)和生物合成功能穩(wěn)定性，目前已在體外培養(yǎng)5月余，純化傳代25次。具備幾種典型P450亞型酶活性，純化傳代5次的肝雜交瘤細(xì)胞各典型P450酶活性約為原代肝細(xì)胞的40-50％，純化傳代10次后CYP2C、CYP3A活性有所下降，但CYP1A、CYP2D活性無(wú)明顯改變。 結(jié)論：3種不同種屬和組織起源的親本瘤細(xì)胞與大鼠原代肝細(xì)胞融合的結(jié)果傾向于表明：原代肝細(xì)胞與

6、同組織起源的肝癌細(xì)胞融合比與異組織起源的腫瘤細(xì)胞融合效率高；原代肝細(xì)胞與同種屬的腫瘤細(xì)胞融合比與異種屬腫瘤細(xì)胞融合穩(wěn)定。即應(yīng)選擇同種屬起源的肝癌細(xì)胞株與原代肝細(xì)胞融合建立肝雜交瘤細(xì)胞。 目前結(jié)果表明，大鼠肝-H4TG雜交瘤細(xì)胞株至少在較長(zhǎng)的一段培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)能保持較好的藥物代謝活性，在一定程度上可作為原代肝細(xì)胞的替代模型應(yīng)用于藥物代謝研究領(lǐng)域。但對(duì)其代謝活性的長(zhǎng)期穩(wěn)定維持，可能尚有未知影響因素與機(jī)制的參與和作用，值得做進(jìn)一步深入探討