人原代肝細胞的分離、培養(yǎng)及可逆性永生化.pdf

1、第一部分：
　　 【目的】建立大動物肝組織灌流分離原代肝細胞的方法；建立用攜帶永生化基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代肝細胞實現(xiàn)肝細胞可逆性永生化的方法。
　　 【方法】采用改良的四步循環(huán)灌流法分離乳豬肝細胞，然后用SSR＃69包裝細胞釋放的攜帶Cre/LoxP系統(tǒng)/SV40T及潮霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染豬原代肝細胞，潮霉素篩選陽性克隆細胞團，克隆環(huán)挑選目的克隆增生細胞團進行單獨傳代培養(yǎng)。最后添加Cre重組酶，切除兩個LoxP

2、位點間的永生化基因SV40T，實現(xiàn)永生化的逆轉(zhuǎn)。
　　 【結(jié)果】我們共獲得6塊大小合適的豬肝組織，成功分離獲得活性很高的大量原代豬肝細胞(產(chǎn)量：9.4±7.5×106/g 肝組織；活性：94.6±4.2％)。在此基礎(chǔ)上利用SSR＃69釋放的含有SV40T的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染豬肝細胞獲得成功，永生化的肝細胞具有正常肝細胞的形態(tài)特點，能傳代培養(yǎng)。加入Cre重組酶逆轉(zhuǎn)永生化后，肝細胞停止增生。
　　 【結(jié)論】我們建立了大動物肝組織

3、四步循環(huán)灌流法分離原代肝細胞，并成功實現(xiàn)了用攜帶永生化基因SV40T的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染豬原代肝細胞，獲得了永生化的豬肝細胞。
　　 第二部分：
　　 【背景及目的】藥物代謝實驗、生物人工肝及細胞移植等均需要大量的人肝細胞，而目前國際上利用外科手術(shù)切除后廢棄的健康肝組織分離原代肝細胞的經(jīng)驗尚少。本部分實驗旨在建立一種高效利用手術(shù)切除后廢棄的健康肝組織分離人原代肝細胞的方法。
　　 【方法】收集良性肝病患者外科手術(shù)切除

4、后廢棄的健康肝組織，采用我們自己建立的改良四步循環(huán)灌流法分離人原代肝細胞。同時評價獲取肝組織的重量、冷熱缺血時間等對肝細胞分離效果的影響。
　　 【結(jié)果】我們共獲得13塊合適的健康肝組織，其中肝血管瘤患者10例，肝內(nèi)膽管結(jié)石患者3例。所有患者查HCV-Ab、HIV-Ab及HBV-Ag均為陰性。患者手術(shù)前肝功能（ALT,ALB等）均在正常水平，平均年齡47歲（23-57歲），血型：O+型 4例, A+型 6例, AB+型 1例，B

5、+型 2例。肝組織塊重量為27.2±7.8g（15-42g）。熱缺血時間（WIT）10-35min，所有13例組織塊的冷缺血時間（CIT）均＜35 min。分離獲得的細胞產(chǎn)量為4.8±2.1×106/g肝組織，臺酚藍染色后用血球計數(shù)板測肝細胞活率為78.1±10.4％（62％-93％）。
　　 【結(jié)論】1，良性肝?。ㄖ饕歉窝芰黾案蝺?nèi)膽管結(jié)石）行部分肝切除后廢棄的周邊正常肝組織，可以采用改良的四步循環(huán)灌注法分離獲得大量活性好的

6、人肝細胞。2，對于存在中度以下纖維化的肝組織，如果切緣血管條件好，仍可以有很好的細胞分離效果。3，應(yīng)盡量縮短獲取肝組織的熱缺血時間，提高肝細胞分離效果。4，對于較小的肝組織塊，切面血管條件欠佳者，采用四步循環(huán)灌流法分離肝細胞效果欠佳。
　　 第三部分：
　　 【背景及目的】人原代肝細胞體外培養(yǎng)時增殖困難，且存在培養(yǎng)時間短，不能及時獲得等缺陷，使其應(yīng)用受到很大的限制。具有正常肝細胞功能的永生化人源肝細胞，能夠解決細胞來源緊

7、缺的難題。本部分實驗旨在利用逆轉(zhuǎn)錄病毒實現(xiàn)SV40T單個永生化基因的轉(zhuǎn)染，構(gòu)建人源肝細胞的可逆性永生化。
　　 【方法】用SSR＃69包裝細胞釋放的攜帶Cre/LoxP系統(tǒng)/SV40T及潮霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人原代肝細胞，7天后用潮霉素篩選陽性克隆細胞團，用合適大小的克隆環(huán)挑選目的克隆增生的細胞團進行單獨傳代培養(yǎng)。最后添加Cre重組酶，以切除兩個LoxP位點間的永生化基因SV40T，實現(xiàn)永生化的逆轉(zhuǎn)。RT-PCR及免疫熒

8、光染色驗證永生化基因SV40T的存在。
　　 【結(jié)果】逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染7天，潮霉素進行篩選14天后，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)大量克隆增生的細胞團，形態(tài)類似肝細胞?？寺…h(huán)挑選至新培養(yǎng)瓶中單獨培養(yǎng)，細胞能傳代培養(yǎng)并保持形態(tài)規(guī)則。添加Cre重組酶后逆轉(zhuǎn)永生化后，細胞即停止生長。RT-PCR檢測永生化細胞具有人原代肝細胞的標(biāo)志基因，免疫熒光染色亦驗證永生化細胞內(nèi)SV40T的存在。
　　 【結(jié)論】我們建立的可逆性永生化人源肝細胞，具有肝細胞的功