永生化成人肝細胞的構(gòu)建及生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、肝功能衰竭是各種嚴重肝病的終末期表現(xiàn)，是威脅人類健康的重要原因之一，雖然原位肝移植是目前治療肝細胞衰竭的最有效手段，但卻受到捐獻器官短缺和手術(shù)費用較高的限制，而建立有效的人工肝治療，一方面可以為尋求合適的肝移植供體提供時間，另一方面可以為肝細胞再生爭取時間。目前各種物理型人工肝輔助治療系統(tǒng)雖然有不錯的療效，但仍無法替代肝臟的各種復(fù)雜生物學(xué)功能。隨著細胞生物學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，體外生物人工肝支持系統(tǒng)(extracorporeal bio

2、artificial liver support system，EBLSS)在肝功能衰竭治療方面的應(yīng)用，正日益受到人們的關(guān)注。原代人肝細胞無疑是體外生物人工肝支持系統(tǒng)的治療最為理想的肝細胞來源，但原代人肝細胞，增殖傳代極為困難；動物源性肝細胞雖可大量獲得，卻有著極大的風(fēng)險，包括使病人出現(xiàn)人畜共患疾病(如使用豬肝細胞治療有潛在的感染豬內(nèi)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的可能)以及異種蛋白進入病人體內(nèi)導(dǎo)致免疫反應(yīng)等風(fēng)險，因此合適的肝細胞來源問題仍是制約生物人工

3、肝發(fā)展的一個瓶頸問題。目前，通過永生化的方法設(shè)計建立能無限增殖并具有良好生物代謝功能的人源性肝細胞系是解決肝細胞來源問題的主要研究方向之一。
　　 本課題通過將hTERT基因?qū)氤扇烁渭毎鸋L-7702，構(gòu)建了永生化成人肝細胞系(pLN/HL-7702)，并且對導(dǎo)入hTERT基因前后兩種細胞的形態(tài)、增殖狀況、生物學(xué)功能進行了比較和研究，對新建永生化成人肝細胞系(pLN/HL-7702)致瘤性問題進行了初步研究，以期為進一步研究解

4、決生物人工肝細胞來源問題奠定試驗基礎(chǔ)。
　　 研究將攜帶有hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入成人肝細胞HL-7702，通過RT-PCR，western-blot，和IEA(間接免疫熒光法)在基因和蛋白水平對所建細胞系(pLN/HL-7702)進行了鑒定；在倒置相差顯微鏡和透射電鏡下觀察并比較了基因?qū)肭昂蠹毎男螒B(tài)及超微結(jié)構(gòu)；采用MTT染色法檢測在基因?qū)肭昂蟾渭毎脑鲋衬芰ψ兓?，連續(xù)觀察并描繪生長曲線；采用RT-PCR法檢測基

5、因?qū)肭昂蟾渭毎δ芑虮磉_情況；采用western-blot檢測基因?qū)肭昂蟾渭毎毎豍450的表達；并通過軟瓊脂實驗、裸鼠致瘤性實驗對所建細胞系pLN/HL-7702的致瘤性進行了初步分析。
　　 結(jié)果：1.RT-PCR、western-bolt和IEA可檢測到hTERT基因在肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達，可檢測到相關(guān)蛋白；2.光鏡和電鏡觀察細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)基因?qū)肭昂蟾渭毎牟町悾?.細胞增殖實驗表明細胞在導(dǎo)入基因后增殖

6、能力有了明顯的提高；4.肝細胞功能基因的轉(zhuǎn)錄在轉(zhuǎn)染前后均可檢測到；5.基因?qū)肭昂蠹毎锨宓臋z測表明肝細胞的一般生化功能未受影響；6.基因?qū)肭昂蟾渭毎ㄟ^western-bolt均可檢測到細胞色素P450的表達；7。軟瓊脂實驗、裸鼠致瘤性實驗未提示pLN/HL-7702有致瘤性表現(xiàn)。
　　 討論：本研究成功建立永生化成人肝細胞系pLN/HL-7702，其體外增殖能力較原細胞系HL-7702明顯提高，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能方面