SV40大T抗原體外永生化視神經膠質瘤細胞及其生物學特性的研究.pdf

1、膠質瘤是顱內最為多見的惡性腫瘤。發(fā)病率占全身所有腫瘤的1-3％，占顱內腫瘤的35-60％，占小兒腦腫瘤40-65％1,2。視神經膠質瘤(Optic Nerve Glioma，ONG)較為罕見，發(fā)病率為1／10萬，國外報道其占兒童顱內腫瘤的2-5％，國內報道在1％左右3，占眶內腫瘤的6％4。目前的文獻報道認為，90％以上的ONG為低級別的星形膠質細胞瘤，按WH0標準5均為星形細胞瘤Ⅰ-Ⅱ級，其間可混有星形細胞或極少散在的星形細胞6。膠質瘤

2、目前的治療方法雖多7-9，但從臨床療效看，結果不盡如人意，特別是兒童患者10。由于病因不清，無法進行預防和徹底根治，故膠質瘤的治療仍是一個世界性的難題。目前ONG原代培養(yǎng)的細胞性質和特點上更接近于腫瘤在人體原始狀態(tài)細胞，為人類研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制、生長浸潤特性等提供了最佳的手段。常規(guī)的腫瘤細胞原代培養(yǎng)有兩種方法，一種是組織塊法，另一種是酶消化法。由于原代培養(yǎng)的視神經膠質瘤傳代次數有限，制約了進一步的研究。在本世紀初，美國學者Rous發(fā)

3、現了世界上第一個腫瘤病毒(Rotlssarcomavios，Rsv)后，就將病毒與腫瘤的發(fā)生聯(lián)系起來11。猿病毒40(Simian Virus40，SV40)是小DNA病毒，有研究顯示：SV40在體外可以使人和動物的正常細胞發(fā)生惡性轉化，生長活性增強，進而建立細胞株12。本研究旨在探討SV40轉染正常的人視神經膠質細胞瘤，在永生化視神經膠質瘤中的作用。 一、研究目的： 病例診斷視神經膠質細胞瘤一例，組織塊法原代培養(yǎng)的視神

4、經膠質瘤細胞，傳代后以SV40大T抗原將其永生化，擬建立視神經膠質瘤細胞系，并進一步研究其生物學特性。 二、研究方法： 1、病例報告：中山大學眼科醫(yī)院手術室切除的腫瘤標本一例，用福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，HE染色；免疫組織化學GFAP，VIM染色，光學顯微鏡鏡下觀察。 2、同一例視神經膠質瘤，從中山大學眼科醫(yī)院手術室無菌取出帶到實驗室，組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)視神經膠質瘤細胞，并傳代十代，應用倒置顯微鏡和MTT比

5、色法觀察瘤細胞的生長增殖情況，用免疫組織化學染色，掃描和透射電鏡對瘤細胞進行鑒定。 3、采用Lipofectomin2000法，將攜帶SV40大T抗原的質粒tgLS(+)LoxPhyTK-cmvLT轉染入傳代培養(yǎng)至第十代的視神經膠質瘤細胞，Hygromycin B進行克隆篩選，并反復傳代培養(yǎng)；MTT比色法觀察瘤細胞增值情況；細胞克隆實驗觀察瘤細胞的克隆形成能力；透射電鏡、免疫組織化學、RT-PCR進行鑒定。 4、將轉染后

6、的視神經膠質瘤細胞和人黑色素瘤細胞OCM-1在三維培養(yǎng)基(3D-Culture)中進行培養(yǎng)，HE染色形態(tài)學觀察。用RT-PCR檢測血管內皮相關基因，以人黑瘤細胞株OCM-1做陽性對照，人視網膜色素上皮細胞株D-407為陰性對照。 5、將轉染后的視神經膠質瘤細胞放入無血清的限制分化培養(yǎng)基中，倒置顯微鏡下觀察，用免疫組化、免疫熒光以及RT-PCR做鑒定。 三、研究結果： 1、對腫瘤標本的的HE染色和免疫組織化學染色觀

7、察，確診為視神經膠質瘤Ⅰ級。 2、組織塊法成功體外培養(yǎng)該例視神經膠質瘤細胞，初長出來的腫瘤細胞以梭形、圓形及橢圓形為主。細胞貼壁生長，消化后的瘤細胞呈圓或橢圓形。體外培養(yǎng)傳至第3代時，經免疫組化鑒定，視神經膠質瘤細胞已占98％以上。腫瘤細胞傳代至第十代后，出現細胞生長緩慢甚至停滯和凋亡等。透射電鏡可見瘤細胞呈梭形細胞為主，細胞內有膠質絲，免疫組化GFAP、VIM染色瘤細胞陽性。 3、轉染后的視神經膠質瘤細胞可穩(wěn)定、反復傳

8、代，MTT比色法對轉染前的與轉染后的第三代瘤細胞相比較檢測結果顯示，轉染前的視神經膠質瘤細胞可見瘤細胞生長緩慢；轉染后的細胞前四天生長增殖較快，第五天開始出現平臺期。透射電鏡顯示轉染后的視神經膠質瘤細胞中存在病毒顆粒，分布于細胞內，以胞核內為主。免疫組化染色GFAP、VIM、SV40大T抗原均陽性表達。RT-PCR結果SV40大T抗原條帶陽性，證明成功轉染視神經膠質瘤細胞。 4、用轉染后的視神經膠質瘤細胞和人黑色素瘤細胞OCM-

9、1進行三維培養(yǎng)，7天后HE染色光學顯微鏡觀察，看到網格樣的血管擬態(tài)結構。RT-PCR檢測血管內皮相關基因表達顯示轉染后的視神經膠質瘤細胞與OCM-1均表達血管內皮相關基因，而對照組人視網膜色素上皮細胞株D405則無血管相關內皮基因表達。 5、轉染后的視神經膠質瘤細胞在無血清限制性分化培養(yǎng)基中，經倒置相差顯微鏡觀察，均出現了懸浮的神經球樣干細胞團，免疫組化Nestin陽性、GFAP陰性；熒光染色共聚焦顯微鏡觀察Nestin陽性，R

10、T-PCR結果Nestin、Nestin-P、BMI-1、Pax-6、Rxp、CH10P呈陽性表達，證明為腫瘤干細胞。 四、研究結論： 1、人視神經膠質瘤細胞可以原代培養(yǎng)并能傳代，但傳代次數有限。 2、SV40大T抗原能夠成功轉染視神經膠質瘤細胞，細胞生長能力增強，有望建立瘤細胞系。 3、SV40大T抗原轉染后建立的視神經膠質瘤細胞系中，瘤細胞能具備形成血擬態(tài)的潛能。 4、SV40大T抗原轉染后所