SV40大T抗原體外永生化視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為多見的惡性腫瘤。發(fā)病率占全身所有腫瘤的1-3％，占顱內(nèi)腫瘤的35-60％，占小兒腦腫瘤40-65％1,2。視神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Optic Nerve Glioma，ONG)較為罕見，發(fā)病率為1／10萬，國外報道其占兒童顱內(nèi)腫瘤的2-5％，國內(nèi)報道在1％左右3，占眶內(nèi)腫瘤的6％4。目前的文獻(xiàn)報道認(rèn)為，90％以上的ONG為低級別的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，按WH0標(biāo)準(zhǔn)5均為星形細(xì)胞瘤Ⅰ-Ⅱ級，其間可混有星形細(xì)胞或極少散在的星形細(xì)胞6。膠質(zhì)瘤

2、目前的治療方法雖多7-9，但從臨床療效看，結(jié)果不盡如人意，特別是兒童患者10。由于病因不清，無法進(jìn)行預(yù)防和徹底根治，故膠質(zhì)瘤的治療仍是一個世界性的難題。目前ONG原代培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)和特點上更接近于腫瘤在人體原始狀態(tài)細(xì)胞，為人類研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制、生長浸潤特性等提供了最佳的手段。常規(guī)的腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)有兩種方法，一種是組織塊法，另一種是酶消化法。由于原代培養(yǎng)的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤傳代次數(shù)有限，制約了進(jìn)一步的研究。在本世紀(jì)初，美國學(xué)者Rous發(fā)

3、現(xiàn)了世界上第一個腫瘤病毒(Rotlssarcomavios，Rsv)后，就將病毒與腫瘤的發(fā)生聯(lián)系起來11。猿病毒40(Simian Virus40，SV40)是小DNA病毒，有研究顯示：SV40在體外可以使人和動物的正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，生長活性增強，進(jìn)而建立細(xì)胞株12。本研究旨在探討SV40轉(zhuǎn)染正常的人視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，在永生化視神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用。 一、研究目的： 病例診斷視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤一例，組織塊法原代培養(yǎng)的視神

4、經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，傳代后以SV40大T抗原將其永生化，擬建立視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性。 二、研究方法： 1、病例報告：中山大學(xué)眼科醫(yī)院手術(shù)室切除的腫瘤標(biāo)本一例，用福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，HE染色；免疫組織化學(xué)GFAP，VIM染色，光學(xué)顯微鏡鏡下觀察。 2、同一例視神經(jīng)膠質(zhì)瘤，從中山大學(xué)眼科醫(yī)院手術(shù)室無菌取出帶到實驗室，組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并傳代十代，應(yīng)用倒置顯微鏡和MTT比

5、色法觀察瘤細(xì)胞的生長增殖情況，用免疫組織化學(xué)染色，掃描和透射電鏡對瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 3、采用Lipofectomin2000法，將攜帶SV40大T抗原的質(zhì)粒tgLS(+)LoxPhyTK-cmvLT轉(zhuǎn)染入傳代培養(yǎng)至第十代的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，Hygromycin B進(jìn)行克隆篩選，并反復(fù)傳代培養(yǎng)；MTT比色法觀察瘤細(xì)胞增值情況；細(xì)胞克隆實驗觀察瘤細(xì)胞的克隆形成能力；透射電鏡、免疫組織化學(xué)、RT-PCR進(jìn)行鑒定。 4、將轉(zhuǎn)染后

6、的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人黑色素瘤細(xì)胞OCM-1在三維培養(yǎng)基(3D-Culture)中進(jìn)行培養(yǎng)，HE染色形態(tài)學(xué)觀察。用RT-PCR檢測血管內(nèi)皮相關(guān)基因，以人黑瘤細(xì)胞株OCM-1做陽性對照，人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株D-407為陰性對照。 5、將轉(zhuǎn)染后的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞放入無血清的限制分化培養(yǎng)基中，倒置顯微鏡下觀察，用免疫組化、免疫熒光以及RT-PCR做鑒定。 三、研究結(jié)果： 1、對腫瘤標(biāo)本的的HE染色和免疫組織化學(xué)染色觀

7、察，確診為視神經(jīng)膠質(zhì)瘤Ⅰ級。 2、組織塊法成功體外培養(yǎng)該例視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，初長出來的腫瘤細(xì)胞以梭形、圓形及橢圓形為主。細(xì)胞貼壁生長，消化后的瘤細(xì)胞呈圓或橢圓形。體外培養(yǎng)傳至第3代時，經(jīng)免疫組化鑒定，視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞已占98％以上。腫瘤細(xì)胞傳代至第十代后，出現(xiàn)細(xì)胞生長緩慢甚至停滯和凋亡等。透射電鏡可見瘤細(xì)胞呈梭形細(xì)胞為主，細(xì)胞內(nèi)有膠質(zhì)絲，免疫組化GFAP、VIM染色瘤細(xì)胞陽性。 3、轉(zhuǎn)染后的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可穩(wěn)定、反復(fù)傳

8、代，MTT比色法對轉(zhuǎn)染前的與轉(zhuǎn)染后的第三代瘤細(xì)胞相比較檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染前的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可見瘤細(xì)胞生長緩慢；轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞前四天生長增殖較快，第五天開始出現(xiàn)平臺期。透射電鏡顯示轉(zhuǎn)染后的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在病毒顆粒，分布于細(xì)胞內(nèi)，以胞核內(nèi)為主。免疫組化染色GFAP、VIM、SV40大T抗原均陽性表達(dá)。RT-PCR結(jié)果SV40大T抗原條帶陽性，證明成功轉(zhuǎn)染視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。 4、用轉(zhuǎn)染后的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人黑色素瘤細(xì)胞OCM-

9、1進(jìn)行三維培養(yǎng)，7天后HE染色光學(xué)顯微鏡觀察，看到網(wǎng)格樣的血管擬態(tài)結(jié)構(gòu)。RT-PCR檢測血管內(nèi)皮相關(guān)基因表達(dá)顯示轉(zhuǎn)染后的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與OCM-1均表達(dá)血管內(nèi)皮相關(guān)基因，而對照組人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株D405則無血管相關(guān)內(nèi)皮基因表達(dá)。 5、轉(zhuǎn)染后的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在無血清限制性分化培養(yǎng)基中，經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，均出現(xiàn)了懸浮的神經(jīng)球樣干細(xì)胞團，免疫組化Nestin陽性、GFAP陰性；熒光染色共聚焦顯微鏡觀察Nestin陽性，R

10、T-PCR結(jié)果Nestin、Nestin-P、BMI-1、Pax-6、Rxp、CH10P呈陽性表達(dá)，證明為腫瘤干細(xì)胞。 四、研究結(jié)論： 1、人視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以原代培養(yǎng)并能傳代，但傳代次數(shù)有限。 2、SV40大T抗原能夠成功轉(zhuǎn)染視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，細(xì)胞生長能力增強，有望建立瘤細(xì)胞系。 3、SV40大T抗原轉(zhuǎn)染后建立的視神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，瘤細(xì)胞能具備形成血擬態(tài)的潛能。 4、SV40大T抗原轉(zhuǎn)染后所