副溶血弧菌生物菌膜形成特性及亞甲基藍(lán)光動(dòng)力滅活作用研究.pdf

1、副溶血弧菌是生長(zhǎng)在溫暖海洋水域環(huán)境中的嗜鹽菌，也是導(dǎo)致海產(chǎn)品食物中毒的主要致病菌。本文以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus。V.parahaemolyticus)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802為實(shí)驗(yàn)菌，研究其在玻璃表面形成生物菌膜的生長(zhǎng)特性及超聲波的解離作用；采用亞甲基藍(lán)為光敏劑，探究光動(dòng)力殺菌技術(shù)對(duì)副溶血弧菌生物菌膜的滅活作用；研究D-酪氨酸對(duì)副溶血弧菌生物菌膜形成的抑制作用及對(duì)光動(dòng)力技術(shù)滅菌效果的影響；使用激光共

2、聚焦掃描顯微鏡觀察光動(dòng)力滅菌技術(shù)對(duì)副溶血弧菌生物菌膜的滅活效果。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.副溶血弧菌生物菌膜經(jīng)結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察，結(jié)果表明結(jié)晶紫染色法可以用于直接觀察細(xì)菌生物菌膜，操作簡(jiǎn)單易行。副溶血弧菌從單個(gè)浮游菌到形成生物菌膜是一個(gè)復(fù)雜但有序的過(guò)程，從浮游菌附著于物體表面到逐漸形成生物菌膜，菌體數(shù)量從少到多，菌膜形態(tài)從稀疏到緊密，結(jié)構(gòu)從簡(jiǎn)單到復(fù)雜，在生長(zhǎng)過(guò)程中生物菌膜也趨于成熟。在培養(yǎng)副溶血弧菌生物菌膜時(shí)

3、，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌膜的生物量不斷增加，且在最初的0-24h時(shí)生物量增長(zhǎng)顯著，24h后增長(zhǎng)速度逐漸減緩以至趨于平衡。在生物菌膜生長(zhǎng)成熟后期，其生物量甚至?xí)晕⑾陆怠?br>　　2.副溶血弧菌生物菌膜生物量變化的測(cè)定結(jié)果表明，環(huán)境因素對(duì)菌膜形成的影響顯著，當(dāng)培養(yǎng)基鹽度3％，培養(yǎng)時(shí)間24h,培養(yǎng)轉(zhuǎn)速70r/min時(shí)得到的副溶血弧菌生物菌膜已經(jīng)生長(zhǎng)成熟且菌體個(gè)數(shù)達(dá)到2.56×107CFU/cm2。采用頻率為50kHz超聲波，間歇式超聲處理法

4、(每作用30s間隔30s)，在作用總時(shí)間為4min時(shí)可在保持副溶血弧菌菌體活性的同時(shí)達(dá)到最佳菌膜解離效果。
　　3.光動(dòng)力滅菌技術(shù)(Anti-microbial photodynamic technology,APDT)對(duì)副溶血弧菌生物菌膜滅活效果顯著，且影響滅活效果的主要因素為光敏劑亞甲基藍(lán)的濃度及光照時(shí)間。在相同的光照時(shí)間處理下，不斷增大光敏劑的濃度(0.1-1000μg/mL)，光動(dòng)力滅活作用愈顯著。當(dāng)亞甲基藍(lán)濃度一定時(shí)(1

5、0μg/mL)，隨著光照時(shí)間(1-20min)延長(zhǎng)，滅菌效果也逐漸增強(qiáng)。在同樣的滅菌條件下，生物菌膜的對(duì)APDT的抗性比浮游菌強(qiáng)10-100倍。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察法能對(duì)生物菌膜熒光顏色進(jìn)行直觀分析，并且用來(lái)表征亞甲基藍(lán)對(duì)副溶血弧菌生物菌膜的滅活效果。當(dāng)延長(zhǎng)APDT光照時(shí)間或者加大亞甲基藍(lán)作用濃度時(shí)，菌膜呈現(xiàn)出較多的紅色熒光，表明細(xì)菌的滅活量大，光動(dòng)力效果顯著。
　　4.D-酪氨酸對(duì)副溶血弧菌生物菌膜的形成具有明顯的抑制作用，