紫錐菊提取物對小鼠免疫和抗沙門氏菌感染能力的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、紫錐菊（Echinacea purpurea）是近年來備受關(guān)注的一種安全、高效多功能藥用植物，其具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)活性。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)同為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要成員，前者具有吞噬、分泌、組織修復(fù)、抗原遞呈等多種功能，后者為專職抗原提呈細(xì)胞并能分泌多種細(xì)胞因子，兩者均在非特異性免疫（先天性免疫）和特異性免疫（獲得性免疫）中有重要作用。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)主要

2、表達(dá)于巨噬細(xì)胞和DC，該類受體在識別配體后，既能夠通過激活炎癥因子和Ⅰ型IFN分泌，啟動非特異性免疫反應(yīng)，又可以通過促進(jìn)DC成熟并遞呈抗原，啟動特異性免疫反應(yīng)。因此，本研究擬先以小鼠為研究材料，探討紫錐菊提取物（Echinacea purpurea extract，EE）對其機(jī)體免疫功能和抗沙門氏菌感染能力的影響，再以小鼠巨噬細(xì)胞和DC為研究對象，研究EE對兩者免疫功能的影響以及TLR信號通路在此免疫調(diào)節(jié)活動中的作用，最終結(jié)合兩方面的研

3、究結(jié)果，闡明EE調(diào)控小鼠細(xì)胞和機(jī)體免疫功能以及抗沙門氏菌感染能力的機(jī)理。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　?。ㄒ唬〦E對小鼠機(jī)體免疫功能和抗沙門氏菌感染能力的影響
　　50只體重相近的C57BL/6雌性小鼠被隨機(jī)分為5組，對照組、EE組、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，ST）組、EE+ST組和慶大霉素(gentamycin，GM)+ST組，每組10只。對照組、EE組分

4、別以PBS和EE(10mg)連續(xù)灌胃17天，研究EE對正常小鼠機(jī)體免疫功能的影響;ST組、EE+ST組和GM+ST組分別以PBS、EE(10mg)和PBS連續(xù)灌胃17天，并于第15天再灌胃5×108 CFU ST感染小鼠，研究EE對小鼠機(jī)體抗沙門氏菌感染能力的影響。結(jié)果如下:
　　EE對正常小鼠機(jī)體免疫功能的影響:(1)EE對正常小鼠生長和腸粘膜結(jié)構(gòu)無顯著影響，說明其對小鼠機(jī)體具有良好的安全性;(2)EE可顯著提高小鼠機(jī)體免疫功能

5、，提高其脾臟指數(shù);(3)EE可在一定程度上可增強(qiáng)小鼠機(jī)體的抗體分泌功能，增加小腸分泌型IgA(secretory IgA，sIgA)分泌，但對IgG分泌沒有影響;(4) EE可增強(qiáng)小鼠機(jī)體的非特異性免疫功能，顯著上調(diào)小鼠血液、回腸、結(jié)腸、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node，MLN)和肝臟中促炎細(xì)胞因子白介素（interleukin, IL）-6、IL-12、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis fact

6、or, TNF)-α、干擾素（interferon，IFN）-γ和抑炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)并顯著增加其回腸和結(jié)腸的NO產(chǎn)生。
　　EE對小鼠機(jī)體抗沙門氏菌感染能力的影響:(1)EE可緩解ST感染對小鼠機(jī)體和免疫系統(tǒng)的損傷，消除鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica serovarTyphimurium，ST)感染引起的小鼠體重下降，大幅減輕ST感染引起的腸粘膜損傷以及脾臟腫大和CD4+/CD8+值下降;(2)

7、EE可降低腸粘膜的ST感染程度，顯著減少回腸和結(jié)腸粘膜的中性粒細(xì)胞浸潤以及ST在結(jié)腸的定植和ST向肝臟和脾臟中的移位;(3) EE可增強(qiáng)ST感染小鼠機(jī)體的抗體分泌功能，顯著促進(jìn)IgG和sIgA分泌;(4) EE可增強(qiáng)ST感染小鼠機(jī)體的非特異性免疫功能，顯著上調(diào)血液、脾臟、MLN和肝臟中促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ和抑炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)并顯著增加其回腸和結(jié)腸的NO產(chǎn)生。
　　以上結(jié)果提示，EE能夠

8、通過增強(qiáng)小鼠的機(jī)體免疫功能，提高其抗感染能力。
　?。ǘ〦E對小鼠巨噬細(xì)胞免疫功能的影響
　　本研究分別以200μg/mL和100μg/mL EE處理RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系和骨髓源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)，研究EE對兩者免疫功能的影響。結(jié)果如下:
　　EE對RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系免疫功能的影響:(1)EE對RAW264.7細(xì)胞的安全濃度為0-2

9、00μg/mL;(2) EE可激活RAW264.7細(xì)胞，顯著提高酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性;(3) EE可增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬功能;(4)EE可增加RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，顯著上調(diào)促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、抗炎因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth

10、factor, TGF）-β1和抗病毒細(xì)胞因子IFN-β的基因表達(dá)和分泌;(5) EE可增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的NO合成功能，顯著提高誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的基因表達(dá)和活性以及NO產(chǎn)量。
　　EE對小鼠BMDM免疫功能的影響:(1)EE對小鼠BMDM的安全濃度為0-100μg/mL;(2) EE可誘導(dǎo)小鼠BMDM發(fā)生M1型極化，顯著上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因

11、IL-6、TNF-α、IFN-γ、iNOS和表面標(biāo)志CD197的表達(dá);(3)EE可活化小鼠BMDM，并增強(qiáng)其抗原遞呈能力，顯著提高ACP和LDH活性，上調(diào)巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表面表達(dá);(4)EE可增強(qiáng)小鼠BMDM的吞噬功能;(5) EE可增加小鼠BMDM的細(xì)胞因子分泌，顯著上調(diào)促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、抑炎因子IL-10、TGF-β1和抗病毒細(xì)胞因子IFN-β的基因表達(dá)

12、和分泌;(6) EE可提高小鼠BMDM的NO合成功能，提高iNOS基因表達(dá)和活性及NO產(chǎn)量;(7) EE可調(diào)控TLR及其銜接分子MyD88、TRIF的基因表達(dá)，并激活信號分子ERK、JNK、p38 MAPK及NF-κB，以調(diào)節(jié)小鼠BMDM的細(xì)胞因子分泌和NO合成。其中TLR-ERK通路介導(dǎo)了EE誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α和TGF-β1基因表達(dá)和分泌，TLR-JNK通路介導(dǎo)了EE誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN

13、-γ、IL-10和TGF-β1基因表達(dá)和分泌，TLR-p38 MAPK通路介導(dǎo)了EE誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ、 TGF-β1和IFN-β基因表達(dá)和分泌，TLR-NF-κB通路介導(dǎo)了IL-6、IL-12、IFN-γ、 IL-10、TGF-β1和IFN-β基因表達(dá)和分泌，同時，TLR-JNK通路還介導(dǎo)了iNOS的表達(dá)以及NO產(chǎn)生。
　　以上結(jié)果提示，EE不僅能夠激活小鼠巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)其免疫功能，而且可以通過T

14、LR信號通路調(diào)控其細(xì)胞因子分泌和NO合成。
　?。ㄈ〦E對小鼠DC免疫功能的影響
　　本研究分別以400μg/mL EE處理小鼠骨髓源DC(bone marrow-derived DC，BMDC)，研究EE對其免疫功能的影響。結(jié)果如下:(1)EE對小鼠BMDC的安全濃度為0-400μg/mL;(2) EE可促進(jìn)小鼠BMDC成熟，并增強(qiáng)其抗原遞呈功能，顯著上調(diào)DC成熟標(biāo)志CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-Ⅱ的表

15、面表達(dá);(3) EE降低小鼠BMDC抗原攝取能力，降低其吞噬功能和ACP活性;(4)EE可增加小鼠BMDC的細(xì)胞因子分泌，上調(diào)促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、抑炎因子IL-10、TGF-β1和抗病毒細(xì)胞因子IFN-β的基因表達(dá)和分泌;(5) EE可調(diào)控TLR及其銜接分子MyD88、TRIF的基因表達(dá)，并激活信號分子ERK、JNK、p38 MAPK及NF-κB，以調(diào)節(jié)小鼠BMDM的細(xì)胞因子分泌。其中TLR

16、-ERK通路介導(dǎo)了EE誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β1基因表達(dá)與分泌，TLR-JNK通路介導(dǎo)了EE誘導(dǎo)的IL-1β、IFN-γ和IFN-β基因表達(dá)與分泌，TLR-p38 MAPK通路介導(dǎo)了EE誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1和IFN-β基因表達(dá)與分泌，TLR-NF-κB通路介導(dǎo)了EE誘導(dǎo)的IL-12、IFN-γ、TGF-β1和IFN-β基因表達(dá)與分泌。以上結(jié)果提示，EE不