核酸適配體對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)及其菌膜的控制.pdf

1、沙門(mén)氏菌是一類(lèi)常見(jiàn)的人畜共患致病菌，由家禽、鳥(niǎo)畜等傳染給人類(lèi)，易引起胃腸炎、敗血癥、傷寒等感染性疾病，給人類(lèi)和動(dòng)物健康造成巨大威脅。其中，以甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌較為常見(jiàn)。由沙門(mén)氏菌形成的細(xì)菌菌膜在宿主體內(nèi)以及自然環(huán)境當(dāng)中廣泛存在，造成疾病難以治愈和反復(fù)發(fā)作。由甲型副傷寒沙門(mén)氏菌可引起的疾病仍在全球范圍內(nèi)持續(xù)發(fā)生，并越來(lái)越引起人類(lèi)的關(guān)注，因此對(duì)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的實(shí)時(shí)快速檢測(cè)已成為必要。豬霍亂沙

2、門(mén)氏菌以侵害4個(gè)月以下的斷奶仔豬為主，誘發(fā)仔豬腸道疾病，給養(yǎng)殖業(yè)造成直接經(jīng)濟(jì)損失。加之其菌膜的形成加劇了菌膜細(xì)菌的耐藥性，因此發(fā)展新方案用于豬霍亂沙門(mén)氏菌及其菌膜的控制已迫在眉睫。
　　(1)甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的高靈敏性循環(huán)信號(hào)放大檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)以熒光疊加、熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)以及限制性核酸內(nèi)切酶酶解作用為基本原理，構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、低成本的DNA適配體傳感器用于甲型副傷寒沙門(mén)氏菌的熒光檢測(cè)。該傳感器由一條經(jīng)過(guò)延伸的適配體序列

3、、兩條末端修飾上FAM的短序列（探針1和探針2）構(gòu)成。當(dāng)靶標(biāo)不存在時(shí)，由于適配體傳感器與靶標(biāo)的特異性結(jié)合，修飾上FAM的適配體傳感器被吸附到氧化石墨烯上，F(xiàn)AM熒光被淬滅;當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)，修飾上FAM的適配體傳感器從氧化石墨烯表面釋放出來(lái)，從而檢測(cè)到FAM熒光信號(hào)。重要的是，熒光信號(hào)可以通過(guò)核酸內(nèi)切酶Ⅰ介導(dǎo)的靶標(biāo)循環(huán)放大。在最優(yōu)條件下，靶標(biāo)濃度在1×102到1×1011cells/mL范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，且最低檢測(cè)下限為1

4、×102 cells/mL。因此，證明該種檢測(cè)平臺(tái)對(duì)致病菌的檢測(cè)提供了一種高靈敏性和高特異性的檢測(cè)方法，并為其他細(xì)菌的檢測(cè)提供了可能性。
　　(2)核酸適配體-氨芐青霉素共軛物對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌菌膜的控制。本實(shí)驗(yàn)以豬霍亂沙門(mén)氏菌茵膜為研究對(duì)象，以適配體和氨芐青霉素的分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，以酰胺反應(yīng)為連接原理，探索了一種能通過(guò)協(xié)同作用控制菌膜的新方法。在靶細(xì)菌鞭毛蛋白適配體(aptamer3)的3'-末端上修飾氨基，通過(guò)酰胺反應(yīng)使之與氨芐青

5、霉素上的羧基共軛以形成多功能共軛物(Apt-Amp共軛物)。光譜研究確定了共軛物的正確合成，熒光分光光度法證明共軛物保留了適配體的特異性。倒置顯微鏡和原子力顯微鏡(AFM)顯微鏡觀察結(jié)果表明，共軛物對(duì)菌膜具有良好的控制作用。共軛物菌膜抑制效果為71.64％，菌膜消減效果為60.00％，而且效果均優(yōu)于組分（適配體、抗生素），推測(cè)共軛物以協(xié)同作用方式作用于菌膜。初步推測(cè)其作用機(jī)理是利用適配體對(duì)豬霍亂沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白的特異性識(shí)別作用附著在菌膜