阿米洛利降低蛋白尿的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：蛋白尿是腎臟疾病主要的臨床表現(xiàn)之一,也是腎臟病持續(xù)性進(jìn)展的重要因素。一系列大型臨床研究均證實(shí):蛋白尿的多寡以及持續(xù)時(shí)間均直接關(guān)系腎臟疾病的預(yù)后。足細(xì)胞作為腎小球固有細(xì)胞之一,附著于腎小球基底膜(glomerularbasement membrane,GBM)的外側(cè),與腎小球基底膜以及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成腎小球的濾過屏障。作為腎小球血液濾過的最后屏障,足細(xì)胞(podocyte)的改變幾乎參與了所有的蛋白尿相關(guān)性腎病的發(fā)生,并在蛋白尿

2、相關(guān)性腎臟疾病發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。足細(xì)胞已經(jīng)成為針對(duì)蛋白尿研究的關(guān)鍵細(xì)胞,闡明足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制具有重要意義。
　　 目前對(duì)足細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)的研究主要集中在①裂孔隔膜復(fù)合體(SDs)區(qū),包括:nephrin、podocin、ZO-1,CD2AP,P-cadherin,FAT等；②頂端膜蛋白區(qū):Podocalyxin、GLEPP-1；③基底膜相接觸的基底蛋白區(qū):α3β1整合素、Dystroglycan(DG)；④足細(xì)胞骨架蛋白

3、:synaptopodin、α-actinin-4、F-actin等。然而遺憾的是,盡管通過一些單基因或遺傳性腎病綜合征的研究,對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)有了很大進(jìn)展,但對(duì)足細(xì)胞損傷機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍未取得重大進(jìn)展。目前,臨床上蛋白尿的治療缺乏直接針對(duì)靶細(xì)胞-足細(xì)胞損傷分子機(jī)制的治療。
　　 最新研究(Nat Med,2008)發(fā)現(xiàn):在人類腎小球疾病、PAN腎病動(dòng)物模型以及LPS誘導(dǎo)的蛋白尿動(dòng)物/細(xì)胞模型中,尿激酶受體(urokinase r

4、eceptor,uPAR)表達(dá)增加可導(dǎo)致足細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)并導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。uPAR一種糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白,能與一些跨膜蛋白如整合素、小窩蛋白等結(jié)合形成信號(hào)復(fù)合體,在炎癥、腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起著重要作用。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn):基因敲除uPAR(plaur-/-)小鼠同時(shí)予LPS處理,明顯減少蛋白尿發(fā)生；轉(zhuǎn)入表達(dá)的uPAR(plaur cDNA)并予LPS處理,可以讓已經(jīng)敲除uPAR基因的小鼠(plaur-/-)重新出現(xiàn)蛋白尿；這一發(fā)

5、現(xiàn)證明:uPAR的表達(dá)增加,可以導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。由此可見:足細(xì)胞上uPAR是蛋白尿發(fā)生機(jī)制中有著其獨(dú)特作用。
　　 阿米洛利(amiloride)是一種Na通道阻滯劑,已作為利尿藥在臨床上使用。有研究提示:在克隆的腫瘤細(xì)胞株,amiloride可以從mRNA及蛋白兩個(gè)水平,抑制其uPAR的表達(dá),從而降低細(xì)胞的活動(dòng)力。那么,在足細(xì)胞上,amiloride是否能抑制uPAR的表達(dá),降低足細(xì)胞的活動(dòng)力呢?由此,本研究提出這樣的假設(shè),

6、在損傷足細(xì)胞及蛋白尿動(dòng)物模型上,amiloride能通過抑制uPAR的表達(dá),同時(shí)降低足細(xì)胞活動(dòng)力,穩(wěn)定足細(xì)胞,以期達(dá)到降蛋白尿的作用。為了驗(yàn)證上述假說本研究通過建立脂多糖誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型和經(jīng)典的5/6腎切除大鼠模型蛋白尿模型以及體外脂多糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型,分別從體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn),RNA及蛋白質(zhì)兩個(gè)水平觀察阿米洛利對(duì)uPAR表達(dá)的影響,初步探討阿米洛利的降蛋白尿的作用機(jī)制,擬為未來在針對(duì)足細(xì)胞靶細(xì)胞水平上治療蛋白尿提供一種新的治療藥

7、物。
　　 方法：
　　 一、建立脂多糖誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型和經(jīng)典的5/6腎切除大鼠模型蛋白尿模型,觀察阿米洛利對(duì)蛋白尿的影響
　　 (一)脂多糖誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型制作:18只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con)、LPS處理組(LPS)、LPS與amiloride共同處理組(LPS+amiloride),每組6只。LPS組及LPS+amiloride組腹腔注射LPS200ug,Con組給予等量

8、生理鹽水腹腔注射,LPS+amiloride組提前二天給予amiloride10mg·kg-1·d-1灌胃,Con組及LPS組每天給予等量生理鹽水灌胃。
　　 (二)5/6腎切除大鼠模型的制作:43只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham)14只、5/6腎切除組(NTX)14只、5/6腎切除+amiloride干預(yù)組(NTX+amiloride)15只。NTX+amiloride組行5/6腎切除手術(shù),一周后每日給予amilo

9、ride3mg·kg-1灌胃,NTX組行5/6腎切除手術(shù),一周后每日給予等量生理鹽水灌胃,Sham組行假手術(shù),一周后每日給予等量生理鹽水灌胃。
　　 (三)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置及24小時(shí)尿蛋白檢測(cè):脂多糖誘導(dǎo)小鼠蛋白尿模型于第3天留取24h尿液檢測(cè)蛋白濃度后處死并留取腎組織,5/6腎切除大鼠模型分別于2周、4周、8周、12周留取24小時(shí)尿液檢測(cè)尿蛋白量后處死并取腎組織。
　　 二、觀察阿米洛利對(duì)足細(xì)胞活動(dòng)力的影響
　　 (

10、一)足細(xì)胞培養(yǎng):條件永生性小鼠足細(xì)胞由Baylor醫(yī)學(xué)院Danesh教授惠贈(zèng)。首先在5％CO2,33℃培養(yǎng)箱環(huán)境,用含20—100U·mL-1IFN-γ的RPMI1640和10％FBS放入Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中共孵育,使其獲得增殖能力。然后轉(zhuǎn)入5％CO2,37℃培養(yǎng)箱,用不含IFN-γ的DMEM加10％FBS共孵育,經(jīng)10-14天的培養(yǎng)誘導(dǎo),足細(xì)胞進(jìn)入分化階段并最終分化成熟。
　　 (二)足細(xì)胞鑒定及形態(tài)學(xué)觀察:分別對(duì)33℃含I

11、FN-γ培養(yǎng)及37℃不含IFN—γ培養(yǎng)10-14天分化成熟后的足細(xì)胞在相差顯微鏡下直接拍片,觀察其形態(tài)學(xué)差異；免疫熒光采用表達(dá)足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin的細(xì)胞為分化成熟的足細(xì)胞,未分化的足細(xì)胞不表達(dá)synaptopodin蛋白。
　　 (三)按以下分組干預(yù)處理足細(xì)胞:
　　 1)正常對(duì)照組(Con):不加任何干預(yù)因素分化成熟的足細(xì)胞；
　　 2)LPS組(LPS):50·mg·L-1脂多糖與成熟足細(xì)胞

12、共同孵育24h；
　　 3)LPS與amiloride共同干預(yù)組(LPS+amiloride):用50·mg·L-1脂多糖分別與50·mg·L-1阿米洛利共同干預(yù)24h；
　　 (四)轉(zhuǎn)板遷移測(cè)定法(Transwell migration assay):使用龍膽紫染色后,在倒置顯微鏡下攝片,觀察Con組、LPS處理組及LPS與amiloride共同干預(yù)組足細(xì)胞遷移的變化。
　　 (五)刮除法(Wound heal

13、ing assay):在Ⅰ型膠原包被的六孔板爬片上培養(yǎng)細(xì)胞后,刮除細(xì)胞后給予不同的處理,24小時(shí)后觀察Con組、LPS處理組及LPS與amiloride共同干預(yù)組足細(xì)胞損傷修復(fù)的變化情況。
　　 三、阿米洛利對(duì)足細(xì)胞uPAR表達(dá)的影響
　　 (一)脂多糖誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型和經(jīng)典的5/6腎切除大鼠模型蛋白尿模型,觀察阿米洛利對(duì)uPAR表達(dá)的影響
　　 1)行兩種動(dòng)物模型中腎組織冰凍切片,并免疫熒光激光共聚焦觀察

14、synaptopodin、uPAR表達(dá)。
　　 2)提取兩種動(dòng)物模型中腎臟組織mRNA,real-time PCR檢測(cè)各組plaurmRNA表達(dá)。
　　 (二)體外實(shí)驗(yàn)觀察觀察阿米洛利對(duì)uPAR表達(dá)的影響
　　 1)觀察阿米洛利對(duì)足細(xì)胞uPAR mRNA(plaur mRNA)表達(dá)影響:將上述各實(shí)驗(yàn)分組提取細(xì)胞RNA后,并用real-time PCR檢測(cè)各組plaur mRNA表達(dá)。
　　 2)觀察阿米洛

15、利對(duì)足細(xì)胞uPAR蛋白表達(dá)影響
　　 ①通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述實(shí)驗(yàn)分組uPAR蛋白的表達(dá)；
　　 ②運(yùn)用免疫熒光檢測(cè)Con組、LPS組、LPS與amiloride共同干預(yù)組uPAR蛋白表達(dá)；
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齊性用LSD法進(jìn)行組間多重比較,方差不齊用Dunnet

16、t's T3法進(jìn)行組間多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、阿米洛利可以降低脂多糖誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型和5/6腎切除大鼠蛋白尿模型中的蛋白尿
　　 (一)脂多糖誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型中各組蛋白尿的變化:
　　 與Con組相比較,LPS組24小時(shí)蛋白尿明顯升高[(4.12±1.06)mg vs(1.35±0.68)mg；p=0.000],有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與LPS組相比較,LP

17、S+amiloride組尿蛋白明顯降低[(4.12±1.06)mg vs(1.99±0.96)mg；p=0.001],有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LPS+amiloride組24蛋白尿與Con組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.244)。
　　 (二)SD大鼠5/6腎切除模型各組尿蛋白變化:
　　 第2周時(shí),與假手術(shù)對(duì)照組(Sham)相比較,5/6腎切除組(NTX)24小時(shí)尿蛋白明顯升高[(47.50±28.05)mg vs(14.28±3.

18、8)mg,P=0.023],有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與NTX組相比,5/6腎切除并用amiloride干預(yù)組(NTX+amiloride)24小時(shí)尿蛋白無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(51.56±21.03)mg vs(47.50±28.05)mg,P=0.748]。第4周時(shí),與Sham組及NTX+amiloride組相比較,NTX組24小時(shí)尿蛋白無(wú)明顯升高[(50.09±22.34)mg vs(21.77±5.29)mg,P=0.112；(50.09±22.3

19、4)mg vs(33.52±10.11)mg,P=0.411],無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第8周時(shí),與NTX組[(162.39±27.62)mg]相比,NTX+amiloride組[(109.22±31.26)mg]、sham組[(19.38±8.26)mg]24小時(shí)尿蛋白增加量均明顯較低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P值分別為0.004,0.000]。第12周時(shí),與NTX組[(188.31±29.82)mg]相比,NTX+amiloride組[(121.37±

20、31.14)mg]、sham組[(21.32±8.59)mg]24小時(shí)尿蛋白增加量均進(jìn)一步減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P值分別為0.001,0.000]。
　　 二、足細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定結(jié)果足細(xì)胞在33℃含IFN-γ培養(yǎng)基下培養(yǎng),呈鵝卵石樣或樹枝樣交錯(cuò)排列,為增殖狀態(tài)的足細(xì)胞；在37℃無(wú)IFN-γ條件下培養(yǎng)10-14天后,足細(xì)胞分化成熟,胞體變大,胞質(zhì)變淡,呈云朵狀,分出許多初級(jí)及次級(jí)足突相互交錯(cuò),為分化狀態(tài)的足細(xì)胞；33℃ IFN

21、-γ培養(yǎng)條件下足細(xì)胞處于增殖狀態(tài),不表達(dá)足細(xì)胞特異性骨架蛋白synaptopodin；而37℃無(wú)IFN-γ條件下培養(yǎng)10天分化成熟后的足細(xì)胞表達(dá)足細(xì)胞特異性骨架蛋白synaptopodin,可見細(xì)胞內(nèi)拉絲狀細(xì)胞骨架。
　　 三、阿米洛利對(duì)足細(xì)胞活動(dòng)力的影響
　　 (一)轉(zhuǎn)板遷移測(cè)定法(Transwell migration assay):
　　 在Con組、LPS組及LPS+amiloride組,平均每個(gè)視野細(xì)胞

22、數(shù)分別為(248.75±10.11)、(324.25±14.97)和(274.5±8.35)個(gè),LPS組遷移細(xì)胞數(shù)明顯多于其他2組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.000)。
　　 (二)刮除法(Wound healing assay):
　　 為了更直接的分析各實(shí)驗(yàn)組足細(xì)胞的活動(dòng)力改變情況,我們采用刮除法來檢測(cè)足細(xì)胞的損傷修復(fù)能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)24小時(shí)后劃痕內(nèi)正常對(duì)照組、LPS組及LPS+amiloride組分別為(15±4.74

23、)、(42.6±6.88)和(18.4±6.35)個(gè),LPS組刮除后的足細(xì)胞細(xì)胞損傷修復(fù)比Con組和LPS+amiloride組明顯增加(均P=0.000),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而LPS+amiloride組與Con組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.392)。
　　 四、阿米洛利對(duì)足細(xì)胞uPAR表達(dá)的影響
　　 (一)阿米洛利可以抑制LPS誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型及5/6腎切除模型足細(xì)胞uPAR表達(dá):
　　 1)阿米洛利可以抑

24、制兩種模型足細(xì)胞uPAR蛋白表達(dá)激光共聚焦顯微鏡觀察,在LPS誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型上,Con組足細(xì)胞特異性骨架蛋白Synaptopodin主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞,uPAR廣泛存在于腎小管和小球,二者很少在腎小球足細(xì)胞上融合；而LPS組可見uPAR表達(dá)增加,熒光亮度較高,與足細(xì)胞特異性骨架蛋白Synaptopodin在腎小球足細(xì)胞上廣泛融合；在LPS+amiloride組明顯可見uPAR表達(dá)下調(diào),熒光亮度降低,與足細(xì)胞特異性骨架蛋白Sy

25、naptopodin在腎小球足細(xì)胞上融合減少。
　　 同樣在5/6腎切除模型上,NTX組可見uPAR表達(dá)增加,熒光亮度較高,與足細(xì)胞特異性骨架蛋白Synaptopodin在腎小球足細(xì)胞上廣泛融合；與NTX組相比,sham組及NTX+amiloride組,明顯可見uPAR表達(dá)下調(diào),熒光亮度降低,與足細(xì)胞特異性骨架蛋白Synaptopodin在腎小球足細(xì)胞上融合減少。
　　 2)阿米洛利可以抑制兩種模型PLAUR mRNA表

26、達(dá)在LPS誘導(dǎo)小鼠短暫蛋白尿模型上,與con組相比較,LPS組PLAUR mRNA表達(dá)明顯增高,(2.12±0.35 vs1.04±0.14,P=0.000),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LPS組相比較,LPS+amiloride組PLAUR mRNA表達(dá)下調(diào)(2.12±0.35 vs1.30±0.22,P=0.000),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 在5/6腎切除模型上,與sham組相比較,NTX組PLAUR mRNA表達(dá)明顯增高(9.74±1.

27、44 vs1.01±0.13,P=0.000),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與NTX組相比較,NTX+amiloride組PLAUR mRNA表達(dá)下調(diào)(9.74±1.44 vs5.01±1.36,P=0.000),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (二)體外實(shí)驗(yàn)中,阿米洛利可以足細(xì)胞uPAR的表達(dá)
　　 1)阿米洛利對(duì)足細(xì)胞PLAUR mRNA的影響:定量PCR檢測(cè)足細(xì)胞PLAURmRNA表達(dá),LPS組PLAUR mRNA顯著高于Con組(2.4

28、1±0.32 vs1.00±0.00,P=0.000)及LPS+amiloride組(2.41±0.32 vs1.33±0.21,P=0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2)阿米洛利對(duì)足細(xì)胞uPAR蛋白的影響:利用免疫熒光共聚焦技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)分組足細(xì)胞uPAR蛋白表達(dá),LPS組uPAR蛋白熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于正常對(duì)照組和LPS+amiloride組,正常對(duì)照組與LPS+amiloride組熒光信號(hào)無(wú)明顯差異。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組足細(xì)

29、胞uPAR蛋白表達(dá),Con組、LPS組及LPS+amiloride組uPAR蛋白表達(dá)率分別為(10.34±3.25)％,(50.74±6.78)％及(29.97±10.26)％;LPS組uPAR蛋白表達(dá)率明顯高于Con組(P=0.001)及LPS+amiloride組(P=0.014),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 一、在LPS誘導(dǎo)小鼠蛋白尿模型及5/6腎切除大鼠蛋白尿模型兩種經(jīng)典蛋白尿模型中,阿米洛利具有降低蛋白