基于RANKL-RANK介導(dǎo)NF-κB及MAPK通路研究二環(huán)丙化去氫木香烴內(nèi)酯保護(hù)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞的機(jī)制.pdf

1、目的：糖尿病(diabetic mellitus，DM)是嚴(yán)重危害人類健康的全身性代謝疾病，已成為發(fā)達(dá)國家繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大慢性非傳染疾病。本次課題研究LJ對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞的作用以及其潛在的可能分子機(jī)制。本課題組以2型DN小鼠模型db/db小鼠、正常對照db/m小鼠和小鼠永生化足細(xì)胞為研究對象，從體內(nèi)外兩方面研究RANKL與RANK在2型DN足細(xì)胞損傷中的作用，闡明RANKL/RANK介導(dǎo)NF-κB通路及MAPK通路的活化

2、促進(jìn)足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，并進(jìn)一步采用LJ干預(yù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞，探討LJ對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞的作用以及對RANKL/RANK介導(dǎo)的NF-κB通路及MAPK通路的影響。本研究結(jié)果不僅有助于加深對2型DN足細(xì)胞損傷機(jī)制的理解，而且提供了一種治療DN的可能藥物，為今后開發(fā)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的DN候選新藥提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：1.RANKL與RANK介導(dǎo)NF-κB及MAPK通路促進(jìn)足細(xì)胞損傷
　　1.1 動物水平
　　

3、1.1.1 動物分組與處理。
　　1.1.2 檢測指標(biāo)。
　　1.2 細(xì)胞水平
　　1.2.1 足細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　1.2.2 足細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。
　　1.2.3 高糖對足細(xì)胞損傷的影響
　　1.2.4 RANKL與RANK在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　1.2.5 下調(diào)RANK對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的影響
　　1.2.6 NF-κB及MAPK通路在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中的活化情況
　　1

4、.2.7 下調(diào)RANK對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞NF-κB及MAPK通路的影響
　　2.LJ調(diào)控RANKL/RANK介導(dǎo)的NF-κB與MAPK通路改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷
　　2.1 LJ對足細(xì)胞的毒性曲線
　　LJ以0、1.25μ上M、2.5μM、5μM依次倍數(shù)增長至80μM等8個濃度分別干預(yù)37℃經(jīng)14天分化成熟的足細(xì)胞24h后采用MTT法并用酶標(biāo)儀獲取OD值檢測足細(xì)胞的生存率。
　　2.2 LJ對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的

5、影響
　　2.2.1分組與干預(yù):37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱足細(xì)胞分化14天后選擇生長密度一致的細(xì)胞采用無血清DMEM培養(yǎng)基同步化處理12h，LJ分別以2.5μM、5μM、10μM三個濃度干預(yù)，分組為NG組、HG組、HG+2.5μM組、HG+5μM組、HG+10μM組。
　　2.2.2檢測指標(biāo):如同1.2.3.2的檢測指標(biāo)檢測足細(xì)胞遷移、白蛋白濾過、炎癥因子MCP-1的表達(dá)以及nephrin蛋白的表達(dá)等情況。
　　2.3 LJ對R

6、ANKL/RANK介導(dǎo)的NF-κB與MAPK通路的影響
　　2.3.1 分組與干預(yù):如同2.2.1的分組，將分化成熟后的足細(xì)胞分為5各組，分別用高糖或/和LJ干預(yù)24h。
　　2.3.2 檢測指標(biāo):如同1.2.7.2檢測RANKL、RANK、nephrin、NF-κB通路相關(guān)蛋白與MAPK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況以及p65核移位情況。
　　3.統(tǒng)計學(xué)處理
　　計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±SD)表示，應(yīng)用S

7、PSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;多組間結(jié)果的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法，兩組間結(jié)果差異比較采用t檢驗進(jìn)行比較，檢驗的顯著性標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.RANKL與RANK介導(dǎo)NF-κB及MAPK通路促進(jìn)足細(xì)胞損傷
　　1.1動物水平
　　1.1.1 小鼠的生化、炎癥及病理形態(tài)學(xué)相關(guān)指標(biāo)
　　與正常組db/m小鼠比較，db/db小鼠血FB

8、S、FINS、Scr、BUN、TC、TG、ACR等生化指標(biāo)以及小鼠體重明顯增高，其中ACR隨著鼠齡的增長逐漸升高; PAS染色顯示db/db小鼠腎小球系膜區(qū)增生硬化，系膜增生系數(shù)明顯升高;電鏡觀察db/db小鼠腎臟足細(xì)胞足突肥大或融合，基底膜GBM明顯增厚;免疫組化結(jié)果顯示db/db小鼠的足細(xì)胞特征性蛋白nephrin呈現(xiàn)出圍繞著基底膜不連續(xù)、顆粒狀甚至彌散模糊的表達(dá)狀態(tài)，而db/m小鼠的nephrin則呈線性、清晰而完整的表達(dá)狀態(tài);d

9、b/db小鼠尿液中MCP-1蛋白分泌明顯升高，腎臟組織中MCP-1的mRNA表達(dá)亦顯著升高。
　　1.1.2 RANKL與RANK在db/db小鼠腎臟中高表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示與正常組db/m小鼠比較，db/db小鼠RANKL與RANK的蛋白表達(dá)明顯升高，主要沿腎小球基底膜分布，與足細(xì)胞nephrin蛋白表達(dá)位置類似，Western blot結(jié)果進(jìn)一步證明RANKL與RANK在db/db小鼠腎臟中高表達(dá)。
　　1.

10、1.3 NF-κB及p38MAPK通路在db/db小鼠腎臟中激活
　　與正常組db/m小鼠比較，db/db小鼠p-IκBα、p-p65、p-p38的蛋白表達(dá)明顯升高，IκBα降解顯著減少，而總的p65和p38蛋白水平則無明顯變化。
　　1.2細(xì)胞水平
　　1.2.1 高糖對足細(xì)胞損傷的影響
　　與NG組相比，HG組足細(xì)胞遷移能力明顯增強，蛋白流量率明顯升高，MCP-1的蛋白與mRNA表達(dá)亦顯著上升，而nephri

11、n蛋白的表達(dá)則明顯下降，作為滲透壓對照組MA組則與NG無明顯差異。
　　1.2.2 RANKL與RANK在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　與NG組比較，RANKL與RANK在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，且呈高糖刺激時間梯度依賴性。MA組則比較穩(wěn)定，沒有明顯隨刺激時間變化的趨勢。
　　1.2.3 下調(diào)RANK對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的影響
　　與轉(zhuǎn)染無意義序列的對照組比較，si-RANK下調(diào)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞RANK的表

12、達(dá)后，足細(xì)胞遷移能力明顯減弱，蛋白流量率明顯降低，MCP-1的蛋白與mRNA表達(dá)亦顯著下降。
　　1.2.4 NF-κB及MAPK通路在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中的活化情況
　　與NG組比較，NF-κB通路相關(guān)蛋白p-p65、p-IKKβ、p-1κBα與MAPK通路相關(guān)蛋白p-p38、p-ERK、p-JNK在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，且呈高糖刺激時間梯度依賴性?？偟膒65、IKKβ、p38、ERK與JNK則無明顯變化，MA組亦變化

13、不明顯。
　　1.2.5 下調(diào)RANK對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞NF-κB及MAPK通路的影響
　　與轉(zhuǎn)染對照組比較，下調(diào)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞RANK表達(dá)后，RANKL、p-p65、p-IKKβ、p-IκBα、 p-p38、p-ERK與p-JNK等蛋白表達(dá)隨之減少，總的p65、IKKβ、p38、ERK與JNK則無明顯改變。免疫熒光結(jié)果顯示下調(diào)RANK后，高糖誘導(dǎo)的p65入核得到明顯抑制。
　　2.LJ調(diào)控RANKL/RANK介導(dǎo)的NF

14、-κB與MAPK通路改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷
　　2.1 LJ對足細(xì)胞的毒性曲線
　　LJ的藥物毒性曲線接近反“S”型，0-10μM的生存率處于較穩(wěn)定的平臺期，10μM之后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的生存率急劇下降。經(jīng)計算分析得LJ對足細(xì)胞的IC50為18.898μM，IC10為10.232μM。
　　2.2 LJ對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的影響
　　不同濃度的LJ干預(yù)足細(xì)胞后，與HG組比較，隨著藥物濃度的增加，足細(xì)胞

15、的遷移能力逐漸減弱，蛋白流量率逐漸降低，MCP-1的蛋白與mRNA表達(dá)亦逐漸減少，而nephrin蛋白表達(dá)則逐漸升高。
　　2.3 LJ對RANKL/RANK介導(dǎo)的NF-κB與MAPK通路的影響
　　與HG組比較，LJ能夠呈藥物濃度依賴性地抑制RANKL、RANK、p-p65、p-IKKβ、p-IκBα、p-p38、p-ERK與p-JNK等蛋白表達(dá)，總的p65、IKKβ、p38、ERK與JNK則無明顯改變。采用10μMLJ干

16、預(yù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞后，p65的入核情況明顯得到改善。
　　結(jié)論：1.體內(nèi)研究表明DN動物模型腎臟中存在RANKL與RANK高表達(dá)及其下游NF-κB與p38MAPK通路的活化;體外研究表明在高糖環(huán)境中RANKL與RANK介導(dǎo)NF-κB及MAPK通路的活化從而促進(jìn)足細(xì)胞遷移、升高足細(xì)胞白蛋白流量率、增加足細(xì)胞炎癥因子MCP-1的表達(dá)與釋放以及下調(diào)足細(xì)胞裂孔膜相關(guān)蛋白nephrin的表達(dá)。這提示RANKL與RANK介導(dǎo)NF-κB及MAP