富含α2巨球蛋白血清的分子生物學(xué)研究及其在創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎早期干預(yù)治療中的作用.pdf

1、研究背景：
　　前交叉韌帶（Anterior cruciate ligament,ACL）損傷是青壯年尤其是競(jìng)技體育運(yùn)動(dòng)者中最常見(jiàn)的膝關(guān)節(jié)韌帶損傷之一。臨床上以ACL重建術(shù)為其治療的主要方法。但ACL重建術(shù)并不能降低ACL損傷所繼發(fā)的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎(Post-traumatic osteoarthritis，PTOA)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)程。最新的研究表明，在關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后一周內(nèi)關(guān)節(jié)腔即出現(xiàn)大量的炎癥因子及氧自由基等，促使大量的軟骨細(xì)胞凋亡，

2、成為啟動(dòng)PTOA關(guān)節(jié)軟骨退變和損傷的始動(dòng)因素。因此及早抑制這些炎性因子的活性對(duì)阻止或者減緩PTOA的發(fā)展至為關(guān)鍵。α-2巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin，A2M)作為一種廣譜的蛋白酶抑制劑在關(guān)節(jié)軟骨損傷時(shí)被合成和分泌到關(guān)節(jié)液中，可有效地抑制IL-1誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-3、9、13）和多種炎癥因子（IL-1β、6、8, TNF-a和GM-CSF）的活性，但其在關(guān)節(jié)軟骨損傷后血清和關(guān)節(jié)液中分泌情況卻

3、一直未見(jiàn)相關(guān)研究。本課題組在前期研究中也已經(jīng)證實(shí)采用前交叉韌帶切斷術(shù)（Anterior cruciate ligament transection，ACLT）制作的SD大鼠的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎(PTOA)模型中，適量的補(bǔ)充外源性的A2M可以明顯的減緩關(guān)節(jié)軟骨的退變進(jìn)程，具有非常顯著的正性關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用。但所使用的A2M為大分子量蛋白質(zhì)，免疫原性強(qiáng)，異種A2M長(zhǎng)期關(guān)節(jié)腔注射極有可能引起免疫反應(yīng)，因此尋求一種更加簡(jiǎn)單的提純或富含A2M血清的方法

4、并觀察其對(duì)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎（PTOA）的治療效果具有非常重要臨床價(jià)值。
　　研究目的：
　　1）分析A2M在ACL損傷時(shí)血清、關(guān)節(jié)液中的分布變化，明確與關(guān)節(jié)軟骨退化存在的關(guān)聯(lián),為外源性補(bǔ)充A2M提供理論依據(jù)；
　　2）采用超濾離心法制備富含 A2M血清（A2M-Rich Serum，A2MRS），檢測(cè)A2MRS中的A2M的蛋白濃度及蛋白活性，并分析其分子生物學(xué)特性；
　　3）觀察富含A2M血清（A2M-Rich Se

5、rum，A2MRS）對(duì)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎（PTOA）的關(guān)節(jié)軟骨是否具有明顯的治療效果或減緩關(guān)節(jié)軟骨退化的作用。
　　研究方法：
　　1）首先以2月齡96只SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為兩組，每組48只。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)前交叉韌帶切斷術(shù)（Anterior cruciate ligament transection，ACLT）建立PTOA動(dòng)物模型，對(duì)照組采取假手術(shù)切開(kāi)，不行ACLT。術(shù)后3天及1、2、4、8及12周每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組處死8只大鼠，收集

6、血清及膝關(guān)節(jié)盥洗液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠ACL損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的關(guān)節(jié)盥洗液、血清中A2M的濃度變化規(guī)律，同時(shí)采用番紅O固綠染色觀察PTOA隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其關(guān)節(jié)軟骨退化的病理進(jìn)程與體液中A2M的含量變化是否存在某種關(guān)聯(lián)，探討A2M是否可以作為關(guān)節(jié)軟骨退變?cè)缙谠\斷及監(jiān)測(cè)病理進(jìn)程的生物標(biāo)記物,為外源性補(bǔ)充A2M提供理論依據(jù)。
　　2）采用超濾離心法制備富含A2M血清（A2M-Rich Serum, A2MRS），采

7、用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、蛋白免疫印跡法（Western Blot）等方法檢測(cè)其分子生物學(xué)性質(zhì)。
　　3）選取80只健康成年SD大鼠,分為4組，每組20只:Sham+Saline（空白對(duì)照組）、ACLT+HA2MRS（高劑量組）、ACLT+LA2MRS（低劑量組）、ACLT+Saline（陽(yáng)性對(duì)照組）。手術(shù)后3天、2周、4周依據(jù)分組的不同關(guān)節(jié)腔定時(shí)注射30ul生理鹽水或30ul不同濃度A2MRS(高劑量組A2M為20ug/

8、ul,低劑量組A2M為10ug/ul)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)治療后24小時(shí)關(guān)節(jié)腔注射MMP680免疫熒光探針，采用熒光分子斷層成像系統(tǒng)（Fluorescence Molecular Tomography，F(xiàn)MT）動(dòng)態(tài)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP）在關(guān)節(jié)液中濃度的變化，觀察A2MRS對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶是否具有抑制作用。術(shù)后8周統(tǒng)一處死動(dòng)物，小動(dòng)物X線片觀察膝關(guān)節(jié)退變的影像學(xué)表現(xiàn)，印度墨水染色評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨

9、大體損傷情況，并行Mankin’s評(píng)分；脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨采用甲苯胺藍(lán)、番紅O固綠染色、蘇木精-伊紅染色（HE染色）和免疫組化法觀察A2MRS對(duì)PTOA軟骨病理退變是否具有減緩或者修復(fù)作用，采用OARIS評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨的病理變化并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；股骨髁關(guān)節(jié)軟骨采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RT-PCR）對(duì)軟骨組織中II型膠原(COL-II)、X型膠原（COL-X）、基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（Matrix metalloproteinase，

10、MMP-3、13）、軟骨聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Runt蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（Runt-related transcription factor, Runx2)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估富含A2M血清對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷在基因?qū)用嫔系恼{(diào)控作用。采用ELISA檢測(cè)關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP-13）濃度。
　　結(jié)果：
　　1)ACLT術(shù)后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的關(guān)節(jié)軟骨早期大體觀察與組

11、織病理學(xué)觀察并無(wú)明顯的區(qū)別，但術(shù)后8周開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組的關(guān)節(jié)軟骨退化明顯加重。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3天、1周、8周關(guān)節(jié)盥洗液中A2M的濃度較血清中的濃度明顯增高。并且實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3天關(guān)節(jié)液盥洗液中的A2M的濃度與對(duì)照組關(guān)節(jié)盥洗液中A2M濃度相比較明顯增高，術(shù)后1周開(kāi)始迅速降低與對(duì)照組無(wú)差別。
　　2)采用超濾離心法制備的富含A2M血清（A2M-Rich Serum,A2MRS）經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果為：人的血清中A2M的濃度為2.43±0.66mg

12、/ml,富含A2M血清（A2MRS）中A2M的濃度為19.52±4.37mg/ml, A2MRS中的A2M的濃度較正常血清中的濃度提高了8.04倍。蛋白免疫印跡（Western Blot）結(jié)果顯示：富含A2M血清（A2MRS）相比正常血清在180kD處有非常明顯的蛋白濃聚現(xiàn)象。A2M蛋白活性檢測(cè)表明：富含A2M血清（A2MRS）的A2M蛋白活性較正常血清A2M的活性提高2.13倍。
　　3)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察A2MRS對(duì)PTOA關(guān)節(jié)

13、軟骨退化的治療作用，通過(guò)熒光分子斷層成像系統(tǒng)（Fluorescence Molecular Tomography，F(xiàn)MT）檢測(cè)結(jié)果表明：富含A2M血清（A2MRS）早期可以明顯抑制創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（Matrix metalloproteinase，MMP-3、13）。
　　膝關(guān)節(jié)的X光片的影像學(xué)表現(xiàn)：ACLT+Saline組的髕骨下緣有明顯的骨贅增生，其余三組在影像學(xué)表現(xiàn)上均沒(méi)有觀察到明顯的退行性改變。<

14、br>　　印度墨水染色表明：Sham+Saline組中軟骨表面未見(jiàn)明顯損傷，ACLT+Saline組軟骨表面損傷最為嚴(yán)重，而ACLT+A2MRS組關(guān)節(jié)面損傷明顯減輕，其中ACLT+HA2MRS組中軟骨損傷在ACL切斷組中最小，改良Mankin's評(píng)分顯示：ACLT+HA2MRS組和ACLT+LA2MRS與ACLT+Saline組相比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但ACLT+HA2MRS組與ACLT+LA2MRS組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

15、脛骨平臺(tái)番紅O固綠染色、HE染色及甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果均顯示：ACLT+Saline組軟骨厚度明顯變薄，軟骨表面有較多小的裂隙，軟骨細(xì)胞分布紊亂，糖胺多糖染色較差。ACLT+LA2MRS組軟骨細(xì)胞聚集成團(tuán)，軟骨厚度降低，ACLT+HA2MRS組中軟骨表面較為平滑，細(xì)胞排列較整齊，Sham+Saline組軟骨表面完整，結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞分布均勻，糖胺多糖染色良好。
　　OARIS評(píng)分顯示：ACLT+Saline組為10.15±2.88，AC

16、LT+HA2MRS組為5.54±2.61,ACLT+LA2MRS組為4.87±2.74，Sham+Saline為3.05±1.39，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組（ACLT+HA2MRS和ACLT+LA2MRS）與陽(yáng)性對(duì)照組（ACLT+Saline）均有顯著性差異（p<0.0001）,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組（ACLT+HA2MRS和ACLT+LA2MRS）與空白對(duì)照組（Sham+Saline）均有顯著性差異。而ACLT+HA2MRS組與ACLT+LA2

17、MRS組之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不具有顯著性差異（p=0.22）。
　　在II型膠原的免疫組化染色上，ACLT+HA2MRS組和ACLT+LA2MRS組的陽(yáng)性細(xì)胞明顯比ACLT+Saline組染色強(qiáng)，即ACLT+HA2MRS組較ACLT+LA2MRS組陽(yáng)性細(xì)胞要強(qiáng)，但兩組II型膠原的免疫組化染色均低于Sham+Saline組。
　　在X型膠原和MMP-13的免疫組化染色上，ACLT+Saline組陽(yáng)性細(xì)胞在四組中表達(dá)最強(qiáng)，Sham+

18、Saline組的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)最弱，而兩個(gè)治療組 ACLT+HA2MRS組及ACLT+LA2MRS組在X型膠原表達(dá)上介于ACLT+Saline組與Sham+Saline組之間，并且同樣存在劑量依賴性，即ACLT+HA2MRS的X型膠原的表達(dá)比ACLT+LA2MRS組弱。
　　RT-PCR結(jié)果表明A2MRS具有較為明顯的抑制負(fù)性基因X型膠原（COL-X）、基質(zhì)金屬蛋白酶3、13（Matrix metalloproteinase3、13

19、，MMP-3、13）、Runt蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（Runt-related transcription factor, Runxn2)的mRNA表達(dá)。
　　關(guān)節(jié)液中MMP-13的ELISA測(cè)定結(jié)果表明：ACLT+HA2MRS組、ACLT+LA2MRS組與Sham+Saline組中關(guān)節(jié)液中MMP-13濃度均顯著低于ACLT+Saline,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異，但前三組之間組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.關(guān)