a-2巨球蛋白在創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎中作用的研究.pdf

1、第一部分骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)液中蛋白含量變化的初步研究及生物學(xué)標(biāo)記物的探求
　　目的:初步觀察比較骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者與健康人膝關(guān)節(jié)液中蛋白含量的變化，試圖探求一種可靠的生物學(xué)標(biāo)記物來反映創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(PTOA)的進(jìn)程
　　方法:將年齡相仿的OA患者和健康人的關(guān)節(jié)液進(jìn)行SDS-凝膠電泳、考馬斯藍(lán)染色，識別有差異的條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析得到的有表達(dá)差異的蛋白通過Westernblot來確定，進(jìn)一步

2、使用ELISA、免疫組化、PCR等多種方法來驗(yàn)證。將關(guān)節(jié)鏡下軟骨評分情況與關(guān)節(jié)液中篩選出的蛋白濃度進(jìn)行對應(yīng)，檢測此蛋白與軟骨損傷程度的相關(guān)性。
　　結(jié)果:SDS-PAGE電泳、考馬斯藍(lán)染色，比較后發(fā)現(xiàn)OA患者關(guān)節(jié)液中有一條約180kDa的深藍(lán)色條帶，切下進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)A-2巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin，A2M)含量最高。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)OA關(guān)節(jié)液中的A2M表達(dá)水平明顯高于年齡匹配的正常關(guān)節(jié)液中的含量。而OA

3、和健康人關(guān)節(jié)液中A2M的水平都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在血漿中的水平。免疫組織化學(xué)染色顯示，軟骨和滑膜組織都能夠表達(dá)分泌A2M，但在OA的時(shí)候，A2M在這些組織中的表達(dá)明顯增高。人OA軟骨的qPCR結(jié)果顯示絕對病變區(qū)的軟骨A2M的mRNA表達(dá)水平明顯低于其在相對正常區(qū)域的水平。然而，軟骨損傷的嚴(yán)重程度與關(guān)節(jié)液中A2M濃度變化無關(guān)。
　　結(jié)論:OA患者與健康人相比較，關(guān)節(jié)液、軟骨以及滑膜中A2M的表達(dá)水平均是升高的，表明A2M參與了OA的病理生理變

4、化，但是A2M與軟骨的損傷程度并不存在相關(guān)性，它不是一個(gè)合適的監(jiān)測PTOA進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)記物。
　　第二部分 A-2巨球蛋白在軟骨退變過程中的作用研究
　　目的:探求A-2巨球蛋白（Alpha-2-Macroglobulin，A2M）在軟骨退變過程中所發(fā)揮的作用。
　　方法:用ELISA法分別比較骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者血漿中和關(guān)節(jié)液中的A2M和MMP-13含量。通過培養(yǎng)軟骨細(xì)胞、軟骨組織以及

5、軟骨C28/I2細(xì)胞系細(xì)胞，在培養(yǎng)液中先加入IL-1b進(jìn)行刺激2小時(shí)，再加入不同濃度的外源性A2M，48小時(shí)后用Luminex、ELISA等方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中軟骨代謝相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:A2M在OA血漿中的濃度遠(yuǎn)高于它在OA關(guān)節(jié)液中的濃度，而MMP-13在OA血漿中的濃度卻遠(yuǎn)低于它在OA關(guān)節(jié)液中的濃度。在體外研究中，發(fā)現(xiàn)A2M能夠抑制因IL-1b誘導(dǎo)而表達(dá)升高的軟骨分解代謝因子:IL-1b、IL-8、TNF-a、GM

6、-CSF，和軟骨降解酶類:MMP-3、-9、-13，并且A2M抑制MMP-13的活性呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　結(jié)論:A2M是多種軟骨分解代謝因子和軟骨降解酶的有效抑制劑。關(guān)節(jié)損傷后，關(guān)節(jié)腔內(nèi)A2M相對不足，可能是造成創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的原因之一。
　　第三部分關(guān)節(jié)腔內(nèi)補(bǔ)充外源性A-2巨球蛋白對關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用的研究
　　目的:在創(chuàng)傷早期關(guān)節(jié)腔內(nèi)補(bǔ)充A-2巨球蛋白(Alpha-2-Macroglobulin，A2M)，觀察A

7、2M是否可以有效的阻止或者廷緩創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(Post-traumaticosteoarthritis，PTOA)的發(fā)生。
　　方法:運(yùn)用大鼠前交叉韌帶切斷（Anterior cruciate ligament transection，ACLT）制備PTOA模型，將120只雄性大鼠隨機(jī)分為4組:(1)ACLT+鹽水，(2)ACLT+ A2M(1IU/kg)，(3)ACLT+ A2M（2IU/kg）以及(4)假手術(shù)+鹽水。關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥

8、物注射頻率為:手術(shù)后即刻、手術(shù)后3天、以后每周一次。手術(shù)8周后處死動物。通過組織學(xué)染色評估軟骨損傷情況。ELISA評估關(guān)節(jié)盥洗液中MMP-13的水平。PCR法評估軟骨組織中各相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在大鼠PTOA模型中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)早期注射A2M能夠減緩PTOA的病理進(jìn)程以及降低關(guān)節(jié)液盥洗液中MMP-13的水平。與ACLT+鹽水組相比，A2M治療組中，Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)水平明顯升高，而MMP-3，-13，Runx2及X型膠