豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體的研制和基于單抗的檢測PCV2抗原的免疫組化法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、根據(jù)致病性及基因組特征，豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)可分為無致病性1型(PCV1)和有致病性2型(PCV2)。其中PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原體。它還與許多其他豬疾病相關(guān)，如豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis nephropathysyndrome，PDNS)、增生性壞死性

2、肺炎(proliferative necrotizing pneumonia，PNP)、豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、繁殖障礙、先天性震顫、腸炎等疾病。這些疾病的廣泛流行嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)，給許多國家和地區(qū)帶來巨大的損失。PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各種病原的繼發(fā)感染，造成的間接損失難以估計。PCV2已經(jīng)成為嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一。目前，還沒有一種特

3、異、敏感、標(biāo)準(zhǔn)化的診斷試劑用于PCV2的定量檢測及臨床樣品的診斷。本研究的目的是進行PCV2特異性單克隆抗體的研制，為建立PCV2TCID50的測定及PCV2的免疫學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。
　　 利用本室研制的嵌合型PCV1-2滅活制劑作為免疫原免疫BABL/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用PCV1、PCV2病毒及其純化蛋白作為篩選抗原，分別經(jīng)間接免疫熒光(indirect immunofluorescence as

4、say，IFA)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(indirect enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)篩選，共篩選到4株雜交瘤，分別命名為1E8、3F9、5G4、7G6。間接免疫熒光結(jié)果顯示1E8能與PCV2發(fā)生反應(yīng)，5G4能同時與PCV1和PCV2發(fā)生反應(yīng)，而3F9和7G6無熒光反應(yīng)性。間接ELISA結(jié)果顯示，1E8和7G6只與提純的PCV2蛋白發(fā)生反應(yīng)，而3F9和5G4能同時與提純的PCV1和PC

5、V2蛋白發(fā)生反應(yīng)。這4株單抗制備的腹水分別經(jīng)過間接免疫熒光、間接ELISA法、Western-blot、免疫組織化學(xué)、病毒-抗體中和試驗進行測定和鑒定。間接免疫熒光測得1E8對PCV2的熒光效價可達1∶3200；間接ELISA法測得1E8和7G6對PCV2的效價分別為1∶12800和1∶6400。Western-blot結(jié)果顯示，這4株單抗同時針對PCV的ORF2反應(yīng)；免疫組化結(jié)果表明，1E8和5G4對組織中的PCV2抗原具有較好的反應(yīng)

6、性；中和試驗結(jié)果表明，1E8和5G4對PCV2病毒具有中和效應(yīng)，中和價分別為1∶267和1∶93。這四株單抗的抗體亞類均為IgG1。
　　 從豬屠宰場收集104份豬腹股溝淋巴結(jié)，通過PCR方法和免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)檢測PCV2的抗原分布情況，以及通過IHC鑒定PCV2特異性單抗與臨床樣品中PCV2的結(jié)合能力。結(jié)果表明，PCR方法、IHC法檢測豬PCV2陽性率為分別為22.1％和27.9％