熱休克預(yù)適應(yīng)促進(jìn)骨髓來源Sca-1+干細(xì)胞存活的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、心肌梗死已成為危害老年人身體健康的主要疾病之一。目前藥物治療(抗凝、溶栓)、冠狀動(dòng)脈介入治療和冠狀動(dòng)脈旁路搭橋雖能改善癥狀,使閉塞血管再通,卻不能再生心肌。近年來的研究發(fā)現(xiàn),人體存在多器官來源的干細(xì)胞,這些干細(xì)胞具有多向分化潛能,可以直接定向分化為成熟心肌或間接促建心肌細(xì)胞再生。目前胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞、心肌干細(xì)胞以及最近發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等多種細(xì)胞,已被用于體外實(shí)驗(yàn)和缺血性心肌病動(dòng)物模型的研究。隨著干細(xì)胞技術(shù)

2、的出現(xiàn)和成熟,人們在這一領(lǐng)域取得了前所未有的進(jìn)步。干細(xì)胞移植為病損心肌的重建和功能恢復(fù)提供了一種全新的治療策略。
　　 然而,兩大問題困擾著干細(xì)胞從基礎(chǔ)到臨床的轉(zhuǎn)化:(1)如何提高干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)效率?(2)如何提高干細(xì)胞在移植后梗死心肌的存活率?本課題圍繞第二個(gè)問題展開研究。
　　 干細(xì)胞能夠向心肌細(xì)胞分化,具有修復(fù)心肌組織的潛能。一般認(rèn)為,干細(xì)胞執(zhí)行心臟修復(fù)的功能,需要一定數(shù)量的具有活性的干細(xì)胞作為基礎(chǔ)。但

3、是移植后的存活率極低。一些研究報(bào)道骨骼肌成肌細(xì)胞70-80％在移植后3天內(nèi)死亡,而另一些研究組報(bào)道的死亡率更高,2天內(nèi)死亡率達(dá)93％。有文獻(xiàn)報(bào)道,在自身免疫缺陷小鼠模型中,移植間充質(zhì)細(xì)胞4天后僅有少于0.44％細(xì)胞存活；而采用冠脈注射法對(duì)大鼠移植干細(xì)胞,4周后僅余0.55％的干細(xì)胞存活。可見,在進(jìn)行了MSCs移植后,可發(fā)生大量的細(xì)胞損失(cell lose)。MSCs移植的治療效果與細(xì)胞在移植入心肌的原位存活率密切相關(guān),只有具備長期存活

4、力的干細(xì)胞,才能夠向心肌細(xì)胞分化,執(zhí)行心肌修復(fù)的能力。因此,細(xì)胞的大量丟失在極大程度上限制了干細(xì)胞移植的效果,這一觀點(diǎn)不僅有大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)支持,同時(shí)得到了許多臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。低氧是細(xì)胞損失的重要因素,低氧通過造成大量的細(xì)胞損失在極大程度上限制了干細(xì)胞移植。在體內(nèi)環(huán)境中,低氧與血清剝奪共同發(fā)揮作用,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。也是本研究使用糖氧剝奪模型誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的理論基礎(chǔ)。
　　 為了提高干細(xì)胞移植后的存活率,國內(nèi)外學(xué)者采取了各種各樣的努力,

5、并發(fā)展了許多有效的策略,比如Bcl-2或Akt,GSk-3D基因修飾的MSCs對(duì)心肌梗死大鼠進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)存活率,血管密度以及大鼠心臟功能的恢復(fù)得到改善。然而基因轉(zhuǎn)染可能會(huì)導(dǎo)致免疫排斥,癌變等問題。那么是否存在單純物理方法就能提高干細(xì)胞的心肌存活率?既往有報(bào)道熱休克能促進(jìn)神經(jīng)元存活,但對(duì)干細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)國內(nèi)外至今未見報(bào)道。因此,本課題將圍繞熱休克對(duì)干細(xì)胞的效應(yīng)進(jìn)行研究:(1)熱休克能否促進(jìn)干細(xì)胞存活?(2)若能促進(jìn)存活,其中起關(guān)鍵作用的

6、分子伴侶是什么?其調(diào)控機(jī)制是什么?(3)該分子伴侶的靶標(biāo)是什么?回答這些問題,以期解決干細(xì)胞移植治療心肌梗死的部分關(guān)鍵問題。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 1.熱休克顯著促進(jìn)熱休克蛋白70(Hsp70)上調(diào):將骨髓來源的Sca-1細(xì)胞種植在培養(yǎng)皿24小時(shí)后行熱休克處理(42℃,0.5％CO2),時(shí)間分別為15min,30min,1 h,2h,3h。而非熱休克細(xì)胞(control,CL)則在37℃,0.5％CO2環(huán)境中放置3h

7、。處理結(jié)束后收集蛋白,用免疫印跡檢測Hsp20、Hsp27、Hsp70、Hsp90蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn),Hsp20、Hsp27、Hsp90表達(dá)沒有變化而Hsp70在熱休克2h后上調(diào),3h后達(dá)峰值。
　　 HSP70是亞基分子量為70KD,考慮其到分子量較大,我們猜想其合成需一定時(shí)間,故我們探討了熱休克后不同的孵育時(shí)間對(duì)Hsp70表達(dá)的影響。結(jié)果讓我們驚奇,我們發(fā)現(xiàn)熱休克14 h后Hsp70顯著上調(diào)(熱休克處理3h組較非熱休克組上調(diào)

8、達(dá)14倍),并持續(xù)到24h。
　　 2.熱休克促進(jìn)干細(xì)胞在糖氧剝奪模型中的存活,保護(hù)效應(yīng)由Hsp70介導(dǎo):將熱休克處理并孵育14小時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行糖氧剝奪處理(Oxigen GlucoseDeprivation,OGD),通過LDH及TUNEL動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞死亡變化,發(fā)現(xiàn)OGD后8h,非熱休克處理組細(xì)胞死亡顯著增加(～40％),而HS-3h組細(xì)胞死亡減少(～20％)。隨后我們用流式細(xì)胞術(shù)行 Annexin-Ⅴ檢測,進(jìn)一步確認(rèn)了這一變化

9、。充分說明熱休克能促進(jìn)干細(xì)胞存活。當(dāng)用小分子干擾RNA敲低Hsp70表達(dá)后,熱休克的保護(hù)效應(yīng)顯著降低,說明Hsp70為介導(dǎo)熱休克促進(jìn)干細(xì)胞存活的關(guān)鍵分子。
　　 3.Akt促進(jìn)HSF1向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位:熱休克顯著促進(jìn)Hsp70上調(diào),那么上調(diào)的機(jī)理是什么?我們在同一張膜上檢測了兩個(gè)常見的影響細(xì)胞存活信號(hào)分子Akt和ERK的磷酸化情況,發(fā)現(xiàn)Hsp70上調(diào)的同時(shí)Akt的磷酸化(ser-473)顯著增強(qiáng)而ERK沒有變化。而在行熱休克前加入P

10、I3K抑制劑LY294002(40μM)能顯著抑制熱休克誘導(dǎo)的Hsp70表達(dá)(與ERK抑制劑組和DMGO組相比)。因而確定Akt為調(diào)控Hsp70誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵分子。
　　 大量的研究報(bào)道在被熱刺激所激活后,在細(xì)胞漿中的熱休克因子1(HeatShock Factor1,HSF1)進(jìn)入細(xì)胞核,與Hsp70的啟動(dòng)子結(jié)合,直接促進(jìn)Hsp70轉(zhuǎn)錄。我們因而猜想Akt是否通過促進(jìn)HSF1轉(zhuǎn)位而誘導(dǎo)Hsp70表達(dá)?WesternBlot結(jié)果顯

11、示,熱休克前胞漿HSF1高度富集而細(xì)胞核含量較少,熱休克后卻恰恰相反,胞漿HSF1含量顯著減少而細(xì)胞核內(nèi)高度富集,而同時(shí)公認(rèn)的HSF1抑制物GSK-3β的活化受到抑制。而當(dāng)加入PI3K抑制劑LY294002(40μM)時(shí),HS目的這種轉(zhuǎn)位被顯著抑制。而同時(shí)GSK-3β的抑制物重新活化。因而Akt通過抑制GSK-3β進(jìn)而促進(jìn)HSF1向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。
　　 4.miR-34a為靶向Hsp70的microRNA:除了HSF1直接激活Hs

12、p70引起Hsp70上調(diào)外,那么是否存在轉(zhuǎn)錄水平以外機(jī)制導(dǎo)致Hsp70表達(dá)上調(diào)?近年來發(fā)現(xiàn)microRNA在轉(zhuǎn)錄后水平影響蛋白翻譯,進(jìn)而減少蛋白合成。生物信息學(xué)的分析預(yù)測miR-34a可能是靶向Hsp70的microRNA,我們其后展開了miR-34a與Hsp70的靶標(biāo)確認(rèn)工作。包括:gain-of-function,loss-of-function以及報(bào)告基因熒光素酶活性檢測。Gain-of-function的結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-34

13、a mimic(模擬物),Hsp70蛋白表達(dá)較negative control和native(不轉(zhuǎn)染)顯著下調(diào)。而loss-of-function顯示轉(zhuǎn)染miR-34a鎖核苷酸抑制劑(LNA inhibitor)Hsp70表達(dá)較negative control和native(不轉(zhuǎn)染)相比Hsp70蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。Gain-of-function和loss—of-function的結(jié)果強(qiáng)烈提示miR-34a為調(diào)控Hsp70的microR

14、NA,但Hsp70是否為miR-34a的直接靶標(biāo)尚需熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證。于是我們構(gòu)建了Hsp703'UTR熒光素酶報(bào)告基因載體并分別將miR-34a mimic及陰性對(duì)照miR negative control與Hsp703'UTR熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染,48小時(shí)后裂解細(xì)胞并檢測熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示,Hsp703'UTR luciferase reporter+miR-34a mimic組的熒光表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)與對(duì)照組顯著降低,說明mi

15、R-34a對(duì)Hsp70的3’UTR有較強(qiáng)的結(jié)合作用,能抑制螢火蟲熒光素酶的表達(dá)。miR-34a為直接靶向Hsp70的microRNA。
　　 5.HSF1能抑制miR-34a表達(dá),間接促進(jìn)Hsp70上調(diào):既然miR-34a能抑制Hsp70的表達(dá)。一個(gè)很自然想到的問題是其在熱休克模型中的內(nèi)源性表達(dá)情況如何?我們通過Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn),行熱休克處理后miR-34a顯著下調(diào)達(dá)70％。那么miR-34a下調(diào)的原因是什么?而現(xiàn)今認(rèn)為DNA

16、甲基化和組蛋白修飾是導(dǎo)致microRNA下調(diào)的重要原因。而我們用重亞硫酸鹽檢測方法檢測DNA甲基化,發(fā)現(xiàn)熱休克后miR-34a啟動(dòng)子上DNA甲基化未發(fā)生顯著改變,而染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)結(jié)果則顯示染色質(zhì)打開的一個(gè)重要標(biāo)記組蛋白H3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)在miR-34a啟動(dòng)子上的修飾明顯減少,而染色質(zhì)關(guān)閉的一個(gè)重要標(biāo)記組蛋白H3賴氨酸27三甲基化(H3K27me3)在miR-34a啟動(dòng)子上的修飾明顯增強(qiáng),而同時(shí)啟動(dòng)miR

17、-34a轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶Ⅱ在miR-34a啟動(dòng)子上的富集顯著減少。說明組蛋白修飾,尤其是H3K27me3修飾增強(qiáng)是導(dǎo)致miR-34a下調(diào)的重要原因。而既往研究表明H3K27me3修飾增強(qiáng)是由于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在啟動(dòng)子上招募一系列表觀調(diào)控因子導(dǎo)致這一修飾改變。那么miR-34a究竟結(jié)合了什么轉(zhuǎn)錄因子抑制了其轉(zhuǎn)錄?
　　 有趣的是,我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-34a啟動(dòng)子上存在HSF1結(jié)合位點(diǎn)。我們立即進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn),確認(rèn)了m

18、iR-34a啟動(dòng)子上的確存在HSF1結(jié)合,且熱休克后HSF1在miR-34a啟動(dòng)子的富集顯著增強(qiáng)。之后,我們用小分子干擾RNA敲低HSF1表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-34a能顯著上調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)說明HSF1很可能通過在miR-34a啟動(dòng)子上富集,引起抑制H3K27me3修飾增強(qiáng),使maR-34a啟動(dòng)子周圍的染色質(zhì)關(guān)閉,轉(zhuǎn)錄下調(diào),從而引起miR-34a表達(dá)降低。
　　 6.細(xì)胞色素C氧化酶亞單位4(Cox-Ⅳ)為新發(fā)現(xiàn)的Hsp70結(jié)合蛋白:盡

19、管發(fā)現(xiàn)了Hsp70為介導(dǎo)熱休克效應(yīng)的關(guān)鍵分子,但Hsp70作為分子伴侶,其最終的功能是要確保蛋白在應(yīng)激情況下正確折疊或免遭降解。那么在我們確立的對(duì)干細(xì)胞有保護(hù)效應(yīng)的熱休克模型中,Hsp70要保護(hù)的蛋白是什么?
　　 首先利用蛋白組學(xué)技術(shù)尋求與Hsp70相互作用蛋白,試圖回答這一問題。我們的策略是首先進(jìn)行免疫共沉淀,把跟Hsp70結(jié)合的蛋白盡可能pull down下來,然后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備了兩組細(xì)胞,一組細(xì)胞給予熱休克刺激(

20、HS3h-incu14h),另一組細(xì)胞不給予熱休克刺激(HSOh-incu14h),然后兩組細(xì)胞均給予亞致死量刺激(OGD4h)后收集蛋白,進(jìn)行免疫共沉淀(抗Hsp70抗體沉淀)。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行還原,烷基化,胰蛋白酶消化后進(jìn)行高效液相色譜二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-MS/MS),并對(duì)肽序列進(jìn)行測序鑒定。所鑒定的肽序列中,有2段跟Cox-Ⅳ完全匹配。而免疫熒光發(fā)現(xiàn)Cox-Ⅳ與Hsp70存在共定位現(xiàn)象。生物信息學(xué)預(yù)測也發(fā)現(xiàn)Hsp70存在兩個(gè)高度

21、同源的結(jié)構(gòu)域,提示Cox-Ⅳ可能為新發(fā)現(xiàn)的Hsp70結(jié)合蛋白。最后,我們再次進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(抗Hsp70抗體),發(fā)現(xiàn)Hsp70抗體能有效捕獲Hsp70,而normal IgG卻不能捕獲Hsp70,說明了我們進(jìn)行免疫共沉淀的抗體具有特異性。并且在熱休克組中,利用抗Hsp70的抗體pull down下來的產(chǎn)物能同時(shí)檢測到Cox-Ⅳ,而在非熱休克處理組中不存在(結(jié)果與質(zhì)譜分析結(jié)果一致)。這些結(jié)果充分說明Cox-Ⅳ為新發(fā)現(xiàn)的Hsp70結(jié)合蛋

22、白。
　　 那么Hsp70對(duì)Cox-Ⅳ是否有保護(hù)作用?我們首先檢測了OGD4h后熱休克組和非熱休克組的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)熱休克組Cox-Ⅳ組表達(dá)顯著較非熱休克組上調(diào)。而敲低Hsp70表達(dá)能下調(diào)Cox-Ⅳ的表達(dá)。說明Hsp70對(duì)Cox-Ⅳ能調(diào)控Cox-Ⅳ表達(dá)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.熱休克促進(jìn)骨髓來源Sca-1干細(xì)胞存活；
　　 2.熱休克的保護(hù)效應(yīng)通過上調(diào)Hsp70介導(dǎo);
　　 3.miR-34a