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文檔簡介
1、目的:胚胎干細胞(embryonicstemcells,ESCs)成為當今生命科學和生物技術(shù)研究的熱點,這是因為它具有自我更新和多能分化的能力。多年來,“成體組織中是否存在胚胎干細胞”一直是一個很有爭議的問題,很多實驗室已報道可以從骨髓中分離出來ESCs樣的多能干細胞,這些細胞都表達ESCs特異性標志Oct4基因,能像ESCs一樣無限分裂繁殖,而且可以分化成幾乎所有類型的細胞。但是對于這些原始細胞的來源和存在機制,人們并不清楚。因此,骨
2、髓中是否存在ESCs就變成了一個很有爭議的問題。
之前的研究都是通過不同的方法從骨髓中分離、提取并培養(yǎng)這些ESCs樣的干細胞,而我們首次通過相反的方式直接將小鼠ESCs注入到小鼠的骨髓腔里,通過觀察ESCs在體內(nèi)的分布生長情況,從而思考體內(nèi)是否有這樣一個適宜ESCs生存的環(huán)境。
方法:為了更好地追蹤ESCs在體內(nèi)的生長情況,我們新建兩株帶綠色熒光標記(greenfluorescentprotein,GFP)的
3、ESCs--oGFP+ESCs(C57BL/6×Oct4/EGFP轉(zhuǎn)基因OG2小鼠);和aGFP+ESCs(129/Sv×CAG/EGFP轉(zhuǎn)基因C57BL/6-Tg小鼠)。oGFP+ESCs中GFP的表達受Oct4啟動子調(diào)控,Oct4表達時GFP才表達;aGFP+ESCs中GFP的表達受chicken-beta-actin啟動子調(diào)控,無論細胞分化與否,GFP均表達。為了避免了ESCs在體內(nèi)其它器官的阻滯和損失,我們直接將ESCs通過脛骨
4、注射植入到同源的C57BL/6小鼠(分照射組和非照射組)骨髓腔內(nèi)。
移植后,通過雙光子熒光顯微鏡來觀察GFP+細胞在小鼠骨髓腔里存活的時間和狀態(tài)。另在不同的時間點,我們從移植小鼠的骨髓腔里再次分離出這些GFP+的細胞,采用建立ES細胞系的方法使這些Oct4+-GFP+細胞建成穩(wěn)定細胞系,并檢測這些新建細胞系的功能。通過基因芯片檢測來比較這些細胞系和母代ESCs在基因表達水平上的差異。另一方面,我們通過流式細胞學檢測和體外培
5、養(yǎng)的方式,分析移植的ESCs在骨髓這種造血微環(huán)境下的分化特征。
結(jié)果:通過雙光子熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)100天后,骨髓中仍然存在Oct4-GFP表達的類似ESCs的細胞。大多數(shù)GFP+細胞位于移植側(cè)脛骨的注射部位,也有少部分GFP+細胞位于注射骨對側(cè)的骨髓腔內(nèi)。在不同的時間點,我們從移植小鼠的骨髓腔里分離出這些Oct4+-GFP+的細胞,建成穩(wěn)定細胞系。到目前為止,我們成功建立了8株細胞系,形態(tài)同ESCs。通過對這些Oct4+
6、細胞系的功能性檢測發(fā)現(xiàn)它們具有與ESCs相似的特性,但這種細胞系生成嵌合鼠的嵌合率很低,且不能生殖系傳遞。芯片結(jié)果顯示這些細胞與母代ESCs比較,部分基因表達水平發(fā)生了改變,表觀遺傳學也發(fā)生了逐漸的變化。
另外,移植的ESCs在骨髓腔內(nèi)大多數(shù)分化成了非造血的細胞,形態(tài)多樣,與骨質(zhì)連接緊密,而僅有少部分分化成了造血細胞,并可進入血循環(huán)。
結(jié)論:1)我們的研究首次通過直接將ESCs移植入小鼠骨髓腔來證實了成體環(huán)境
7、中長期存在ESCs的可能性,對以后干細胞的應(yīng)用,在成體內(nèi)的發(fā)育和分化研究具有一定的提示作用:
2)由于原始的胚胎干細胞在體內(nèi)可以長期存在,因此在使用ESCs或ESCs衍生物做細胞治療或移植過程中,安全性一定要長期關(guān)注;
3)胚胎干細胞在成體骨髓中存活一段時間后,逐漸發(fā)生了表觀遺傳學方面的變化,這種變化影響了ESCs的多能性改變,因此在以后細胞移植過程中,我們需要關(guān)注這些細胞表觀遺傳學方面的影響;
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