胚胎干細胞在成體骨髓中長期存活的觀察研究.pdf

1、目的：胚胎干細胞（embryonicstemcells，ESCs）成為當今生命科學和生物技術(shù)研究的熱點，這是因為它具有自我更新和多能分化的能力。多年來，“成體組織中是否存在胚胎干細胞”一直是一個很有爭議的問題，很多實驗室已報道可以從骨髓中分離出來ESCs樣的多能干細胞，這些細胞都表達ESCs特異性標志Oct4基因，能像ESCs一樣無限分裂繁殖，而且可以分化成幾乎所有類型的細胞。但是對于這些原始細胞的來源和存在機制，人們并不清楚。因此，骨

2、髓中是否存在ESCs就變成了一個很有爭議的問題。
　　 之前的研究都是通過不同的方法從骨髓中分離、提取并培養(yǎng)這些ESCs樣的干細胞，而我們首次通過相反的方式直接將小鼠ESCs注入到小鼠的骨髓腔里，通過觀察ESCs在體內(nèi)的分布生長情況，從而思考體內(nèi)是否有這樣一個適宜ESCs生存的環(huán)境。
　　 方法：為了更好地追蹤ESCs在體內(nèi)的生長情況，我們新建兩株帶綠色熒光標記（greenfluorescentprotein，GFP）的

3、ESCs--oGFP+ESCs（C57BL/6×Oct4/EGFP轉(zhuǎn)基因OG2小鼠）；和aGFP+ESCs（129/Sv×CAG/EGFP轉(zhuǎn)基因C57BL/6-Tg小鼠）。oGFP+ESCs中GFP的表達受Oct4啟動子調(diào)控，Oct4表達時GFP才表達；aGFP+ESCs中GFP的表達受chicken-beta-actin啟動子調(diào)控，無論細胞分化與否，GFP均表達。為了避免了ESCs在體內(nèi)其它器官的阻滯和損失，我們直接將ESCs通過脛骨

4、注射植入到同源的C57BL/6小鼠（分照射組和非照射組）骨髓腔內(nèi)。
　　 移植后，通過雙光子熒光顯微鏡來觀察GFP+細胞在小鼠骨髓腔里存活的時間和狀態(tài)。另在不同的時間點，我們從移植小鼠的骨髓腔里再次分離出這些GFP+的細胞，采用建立ES細胞系的方法使這些Oct4+-GFP+細胞建成穩(wěn)定細胞系，并檢測這些新建細胞系的功能。通過基因芯片檢測來比較這些細胞系和母代ESCs在基因表達水平上的差異。另一方面，我們通過流式細胞學檢測和體外培

5、養(yǎng)的方式，分析移植的ESCs在骨髓這種造血微環(huán)境下的分化特征。
　　 結(jié)果：通過雙光子熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)100天后，骨髓中仍然存在Oct4-GFP表達的類似ESCs的細胞。大多數(shù)GFP+細胞位于移植側(cè)脛骨的注射部位，也有少部分GFP+細胞位于注射骨對側(cè)的骨髓腔內(nèi)。在不同的時間點，我們從移植小鼠的骨髓腔里分離出這些Oct4+-GFP+的細胞，建成穩(wěn)定細胞系。到目前為止，我們成功建立了8株細胞系，形態(tài)同ESCs。通過對這些Oct4+

6、細胞系的功能性檢測發(fā)現(xiàn)它們具有與ESCs相似的特性，但這種細胞系生成嵌合鼠的嵌合率很低，且不能生殖系傳遞。芯片結(jié)果顯示這些細胞與母代ESCs比較，部分基因表達水平發(fā)生了改變，表觀遺傳學也發(fā)生了逐漸的變化。
　　 另外，移植的ESCs在骨髓腔內(nèi)大多數(shù)分化成了非造血的細胞，形態(tài)多樣，與骨質(zhì)連接緊密，而僅有少部分分化成了造血細胞，并可進入血循環(huán)。
　　 結(jié)論：1）我們的研究首次通過直接將ESCs移植入小鼠骨髓腔來證實了成體環(huán)境

7、中長期存在ESCs的可能性，對以后干細胞的應(yīng)用，在成體內(nèi)的發(fā)育和分化研究具有一定的提示作用：
　　 2）由于原始的胚胎干細胞在體內(nèi)可以長期存在，因此在使用ESCs或ESCs衍生物做細胞治療或移植過程中，安全性一定要長期關(guān)注；
　　 3）胚胎干細胞在成體骨髓中存活一段時間后，逐漸發(fā)生了表觀遺傳學方面的變化，這種變化影響了ESCs的多能性改變，因此在以后細胞移植過程中，我們需要關(guān)注這些細胞表觀遺傳學方面的影響；