蓖麻毒素A鏈和核糖體蛋白P2相互作用的研究及金黃色葡萄球菌中Rot和SaeRDBD的結(jié)構(gòu)生物學研究.pdf

1、核糖體失活蛋白（RIPs）是一種N-糖苷酶，可以將28S rRNA上一個保守的腺嘌呤脫嘌呤而導致核糖體失活，抑制蛋白質(zhì)的合成。蓖麻毒素(Ricin)是從蓖麻種子中分離出的一種毒素，屬于Ⅱ型RIPs。Ricin的A鏈(RTA)是一個32 KD并具有RNA N-糖苷酶活性的亞基。RTA可以將28S rRNA sarcin-ricineloop(SRL)上一個保守的腺嘌呤移除使核糖體失活。人源stalk蛋白復合物是一個五聚體，包含一個P0和兩

2、個P-P2異二聚體。核糖體stalk蛋白C端的11個氨基酸殘基(SDDDMGFGLFD)高度保守，除了招募延伸因子，還和RIPs相互作用。有研究證實RTA也和stalk蛋白C端保守的11個氨基酸殘基相互作用，但詳細的分子機制還不清楚。
　　在本研究中，我們通過ITC實驗確定了RTA和人源核糖體stalk蛋白P2的相互作用，并且確定RTA主要識別P2高度保守的C端。解析了1.50(A) RTA和P2 C端小肽復合物（RTA-C10-

3、P2）的晶體結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)中觀察到，C10-P2主要插入到RTA的一個疏水口袋中。Pull-down實驗證明了RTA和C10-P2相互作用界面的關(guān)鍵氨基酸殘基。體外抑制蛋白質(zhì)翻譯實驗進一步證明了RTA和stalk蛋白的相互作用對于RTA抑制核糖體合成蛋白質(zhì)是必須的。將RTA-C10-P2復合物結(jié)構(gòu)與天花粉蛋白(TCS)和P蛋白C端復合物(TCS-C11-P)結(jié)構(gòu)進行比較，發(fā)現(xiàn)雖然C端小肽結(jié)合RTA或TCS的構(gòu)象不同，但C端保守的LF花樣在

4、和RTA或TCS結(jié)合中起到至關(guān)重要的作用。進一步的分析發(fā)現(xiàn)LF花樣在真核生物和古細菌的核糖體stalk蛋白中是高度保守的，同時也是翻譯因子結(jié)合核糖體必須的元件，這些結(jié)果表明RTA、TCS以及翻譯因子都是通過疏水相互作用和高度保守的LF花樣相互作用。
　　金黃色葡萄球菌是一種重要的人類病原菌，可以引起肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等多種疾病，尤其是甲氧西林抗性、萬古霉素抗性菌株的出現(xiàn)，使這些疾病更加復雜。這些疾病的多樣性和嚴重性主要依賴于金

5、黃色葡萄球菌中大量毒力因子的表達。毒力因子的表達和分泌是由一系列的調(diào)控因子嚴格調(diào)控的。SarA是金黃色葡萄球菌中一種全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。SarA蛋白家族至少有11個成員，可以直接和目的基因的啟動子區(qū)結(jié)合從而調(diào)控多種毒力因子的轉(zhuǎn)錄。Rot屬于SarA蛋白家族中的單結(jié)構(gòu)域亞家族，它可以影響168種基因的轉(zhuǎn)錄。由于缺乏Rot的結(jié)構(gòu)信息，Rot和目的基因啟動子區(qū)結(jié)合模式的細節(jié)還不清楚。
　　在本研究中，我們解析了1.77(A) Rot蛋

6、白的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)表明一個不對稱單位中有兩個Rot分子，且形成了一個同源二聚體。每個Rot單體都有一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋花樣和β-發(fā)夾花樣，組成經(jīng)典的翼狀螺旋花樣。熒光偏振實驗結(jié)果表明Rot優(yōu)先識別約30個堿基的AT-rich dsDNA。體內(nèi)外實驗證明了Rot翼狀螺旋花樣上的正電荷氨基酸殘基對于Rot識別dsDNA起到非常重要的作用。因此，我們推測Rot和SarA、SarR以及SarS具有相似的識別dsDNA的模式，都是由螺旋-轉(zhuǎn)角-螺

7、旋花樣和dsDNA的大溝結(jié)合，β-發(fā)夾花樣和dsDNA的小溝結(jié)合。分子篩層析和熒光偏振實驗證明Rot是以二體的形式作為最小的功能單位結(jié)合dsDNA的。此外，我們發(fā)現(xiàn)Rot和其他SarA同源物的二體作用模式明顯不同，而這種差異暗示Rot具有不同于其他蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制。
　　雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)(TCS)是細菌、低等真核生物以及植物監(jiān)測環(huán)境調(diào)節(jié)并作出反應(yīng)的一種信號轉(zhuǎn)導機制。金黃色葡萄球菌中有16種保守的TCSs。SaeR/S是其中的一種T

8、CS，該TCS在一些分泌蛋白、細胞壁蛋白以及細胞壁相關(guān)蛋白等毒力因子的表達中起著關(guān)鍵的作用。SaeR屬于反應(yīng)調(diào)控因子OmpR/PhoB亞家族，它包含一個N端的接收結(jié)構(gòu)域(RD)和一個C端的結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域(DBD)。雖然已經(jīng)確定SaeR是通過DBD區(qū)域和目的基因啟動子區(qū)結(jié)合，但是詳細的分子機制還不清楚。
　　在本研究中，我們解析了2.50(A) SaeRDBD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)中觀察到SaeRDBD以單體的形式存在且具有一個

9、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋花樣和β-發(fā)夾花樣，組成經(jīng)典的翼狀螺旋花樣。分子篩層析實驗表明SaeR和SaeRDBD都以單體的形式存在于溶液中。EMSA實驗表明SaeR和SaeRDBD都可以結(jié)合P1啟動子，但SaeR具有更強的dsDNA親和力。體內(nèi)外實驗證明了翼狀螺旋花樣上的5個氨基酸殘基對于SaeR體外結(jié)合P1啟動子和體內(nèi)發(fā)揮生理功能的重要性。因此，我們推測SaeRDBD和PhoBDBD具有相似的識別dsDNA的模式，都是由螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋花樣和d