重組豬肺表面活性蛋白A在體外抑制PRRSV感染宿主細(xì)胞的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的妊娠母豬發(fā)熱流產(chǎn),仔豬與育肥豬呼吸障礙為特征的傳染病,是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一,給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)PRRS進(jìn)行了大量的研究,對(duì)其致病機(jī)理等方面有了深入的了解。
　　 PRRSV是RNA病毒,感染的主要途徑為呼吸道,其宿

2、主細(xì)胞為豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine Alveolar macrophage,PAM),病毒在不同親代之間變異較大。由于沒(méi)有有效的疫苗控制病毒的感染,所以動(dòng)物體的天然免疫系統(tǒng)對(duì)該病毒的抵御作用顯得異常重要。天然免疫系統(tǒng)不僅能及時(shí)清除外來(lái)的病毒,同時(shí)也可促進(jìn)或激活機(jī)體的獲得性免疫系統(tǒng)。已有研究表明,SP-A分子中含有能夠識(shí)別病毒表面多糖分子的結(jié)構(gòu)域,具有一定的抗病毒作用。所以在目前尚無(wú)有效的PRRS疫苗的情況下,通過(guò)研究SP-A抗PRR

3、SV感染宿主細(xì)胞的作用,從先天性免疫方面為抗PRRSV感染的研究提供了新的途徑。
　　 因此,為研究SP-A是否具有抗PRRSV感染宿主細(xì)胞的活性,我們制備了重組豬SP-A蛋白,并在體外進(jìn)行了與PRRSV相互作用的研究。本實(shí)驗(yàn)首先采用PCR方法從含有豬SP-A基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增SP-A基因,并將其插入到含有人CD5信號(hào)肽序列的真核表達(dá)載體pcDNA3.1A-CD5中,構(gòu)建成SP-A基因的真核分泌型表達(dá)載體pcDNA3.1-CD5-

4、SPA/MH。將重組表達(dá)載體通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),通過(guò)Western blot方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物,采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析法從培養(yǎng)基中分離和純化重組SP-A蛋白,通過(guò)ELISA方法檢測(cè)SP-A蛋白與PRRSV的結(jié)合活性。將SP-A蛋白與PRRSV孵育,然后感染MARC-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞,感染72 h后測(cè)定病毒滴度,分析重組豬SP-A蛋白對(duì)PRRSV感染的抑制作用。
　　 結(jié)果表明構(gòu)建

5、的真核表達(dá)載體能夠介導(dǎo)SP-A基因在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá);表達(dá)的重組豬SP-A蛋白能夠與PRRSV進(jìn)行劑量依賴性結(jié)合;用重組豬SP-A蛋白與PRRSV進(jìn)行孵育,然后感染MARC-145細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞,結(jié)果顯示SP-A處理的PRRSV感染細(xì)胞后的病變程度顯著低于對(duì)照組。感染72 h后,SP-A處理組的PRRSV在MARC-145細(xì)胞和PAM細(xì)胞的滴度顯著低于SP-A非處理組。綜上所述,可以得出以下結(jié)論:重組豬SP-A蛋白