神經肽CGRP、SP、NPY對骨髓基質干細胞的生物學效應及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學難題。對于從根本上提高其治療效果而言,明確骨形成、重建、塑形的病理生理學特點及其生物學機制是其基礎和出發(fā)點。骨組織是一種伴隨著細胞外基質礦化、根據需要不斷自我修復的復雜動態(tài)組織,亦是帶有血管、神經支配的生物活性組織,因此,骨折修復過程中既有機體多種組織、細胞因子之間錯綜復雜的協同作用,更與血液供應、神經支配密切相關,其修復區(qū)域內環(huán)境的生物

2、學穩(wěn)定性尤其是血液供應和神經支配的重建是關鍵因素。血液供應的重建對于骨及移植物保持生物學活性的重要性已被眾多實驗及臨床實踐所證實,除此之外,骨組織再生中神經因素可能同樣發(fā)揮著重要作用。在早期進行的骨發(fā)育學研究顯示:一些先天顱面發(fā)育缺陷疾病常常伴有神經系統發(fā)育障礙的現象提示神經系統對骨發(fā)育支配和調節(jié)的重要性。再者,眾多解剖學、神經生物學以及臨床實踐研究均已證實神經因素對骨折愈合、骨修復具有確切的生物調節(jié)作用。但是目前對神經因素調控骨組織再

3、生的生物學機制研究較少。本課題組的前期研究發(fā)現植入感覺神經能夠促進組織工程骨成骨及修復骨缺損,且骨再生區(qū)域的神經肽CGRP、SP、NPY含量明顯增加,提示我們神經肽類物質在骨折愈合、重建中可能起到重要作用,可能是神經發(fā)揮其調控作用的關鍵因素。近年來,神經肽類物質在骨折愈合、骨組織再生中的重要作用已逐漸得到人們的重視,并成為國內、外學者新的研究熱點之一。神經肽是神經系統產生的具有神經調節(jié)活性的肽類物質,具有廣泛的生物學效應,其中,降鈣素基

4、因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、P物質(substance P,SP)、神經肽Y(neuropeptide Y)是最具代表性的物質。CGRP和SP是感覺神經纖維分泌的兩種主要神經肽;NPY是中樞神經系統中含量最高、分布最廣的神經肽之一,介導中樞神經系統與外周神經系統調控的重要因子。目前的研究多局限在神經肽對成骨細胞的影響,對成骨細胞的前體細胞——骨髓基質干細胞(Bone marrow

5、stem cells,BMSCs)的研究較少。BMSCs具有強大的增殖能力和多向分化潛能,在骨代謝中扮演著重要角色,在適宜的體內或體外環(huán)境下可被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞和造血細胞等多種細胞,是骨組織工程研究領域的理想種子細胞。因此,闡明神經肽對BMSCs的具體作用有助于我們更好的了解神經肽在骨代謝過程中發(fā)揮的作用,進一步揭示骨再生過程中的神經生物學作用機制。本實驗通過BMSCs的體外培養(yǎng),從細胞學角度,采用免疫組織化、細胞

6、遷移、PCR和Western Blot等方法,對神經肽及其受體在BMSCs中的表達與生物學效應進行研究,為進一步深入研究骨再生、骨代謝過程中的神經生物學調節(jié)分子轉導機制奠定堅實基礎,同時也可為其在骨折以及骨代謝疾病中的臨床應用提供新的思路和實驗依據。
　　 研究目的
　　 1.明確神經肽CGRP、SP、NPY受體在BMSCs及其成骨分化中的表達趨勢。
　　 2.明確神經肽CGRP、SP、NPY調控BMSCs增殖的

7、作用及其機制。
　　 3.初步探明神經肽CGRP、SP、NPY在BMSCs成骨分化中的生物學效應及機制。
　　 4.初步探明神經肽CGRP、SP、NPY對BMSCs遷移的作用。
　　 研究方法
　　 1.BMSCs及其成骨分化過程中神經肽CGRP、SP、NPY受體的表達檢測
　　 采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓基質干細胞,分別使用流式細胞儀檢測和免疫細胞化學對BMSCs表型標志物和成骨分化進

8、行鑒定,取第2代BMSCs用于實驗。分為誘導成骨組及未誘導組,在BMSCs傳代(第2代)培養(yǎng)的不同時期(1、2、3w),采用Real TimeRT-PCR、Western Blot檢測細胞CGRP、SP、NPY受體mRNA及蛋白表達。
　　 2.神經肽CGRP、SP、NPY對BMSCs增殖的調控作用及其機制研究
　　 將活力大于95％的大鼠第2代BMSCs細胞以104/孔密度種于96孔細胞培養(yǎng)板,細胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基

9、24小時,使細胞同步化于G0期。后以CGRP(10-8mol/L),SP(10-8mol/L),NPY(50nM)分別刺激1,3,5,7d,采用MTT法測定OD值,繪制細胞生長曲線；采用RT-PCR、Western Blot檢測細胞周期調控蛋白的表達。
　　 3.神經肽CGRP、SP、NPY對BMSCs成骨分化的作用及相關生物學機制研究
　　 將CGRP(10-8mol/L),SP(10-8mol/L),NPY(50nM

10、)分別作用于傳代(第3代)培養(yǎng)的BMSCs,常規(guī)培養(yǎng)組作為對照,于不同時間點(1、7、14、21d),應用Western Blot比較分析BMSCs中成骨細胞特征性物質(ALP、BGP)合成情況；應用免疫細胞化學、Western Blot對細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)的表達進行檢測分析。
　　 4.神經肽CGRP、SP、NPY對BMSCs遷移的作用及其機制研究
　　 應用Real

11、TimeRT-PCR、Western Blot檢測血管細胞細胞粘附分子(VCAM-1)表達,對神經肽CGRP、SP、NPY影響B(tài)MSCs粘附及遷移作用機制進行初步分析；利用細胞劃痕實驗、趨化實驗對神經肽作用BMSCs后的遷移能力進行檢測。
　　 5.統計學方法
　　 計量資料以(x)±s表示,選取檢驗水準a=0.05,采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析。
　　 Transwell細胞趨化實驗數據采用多樣本均

12、數比較的方差分析(One-WayANOVA)進行統計學分析,經Levene檢驗滿足方差齊性后,組間比較以LSD方法為準,方差不齊的數據以近似方法DunnetT3分析結果為準。
　　 BMP2、VEGF表達的Western Blot檢測中同一時間點多個組間的數據采用One-Way ANOVA進行統計學分析,經Levene檢驗滿足方差齊性后,組間比較以LSD方法為準,方差不齊的數據以近似方法DunnetT3分析結果為準；同組兩個時間

13、點之間的數據比較采用獨立樣本t檢驗,并檢驗其方差齊性。
　　 其他實驗數據均采用重復測量數據的方差分析；當資料滿足球形假設時以Sphericity Assumed方法為準。當資料不滿足球形假設時需用ε校正系數來校正自由度。對有顯著意義的主效應進行多重比較,采用LSD法。對同一時間點多組別的比較采用One-Way ANOVA進行分析,同一組不同時間點的數據比較采用重復測量的方差分析,經Levene檢驗數據滿足方差齊性以LSD方法為

14、準,方差不齊的數據以近似方法DunnetT3分析結果為準。
　　 結果
　　 1.BMSCs及其成骨分化過程中神經肽CGRP、SP、NPY受體的表達檢測
　　 1.1 BMSCs的分離和鑒定
　　 全骨髓培養(yǎng)的第2代BMSCs表面標志物鑒定結果分別為:CD29(96％)、CD44(95.9％),CD45(2.9％)、CD34(2.6％)；免疫細胞化學結果顯示:成骨細胞誘導7d后,ALP染色陽性,COLⅠ染

15、色陽性；成骨誘導14d后,BGP染色陽性,COLⅢ染色陰性。Western Blot檢測結果顯示:各時間點的成骨誘導組與未誘導組相比ALP、BGP、COLⅠ蛋白含量隨誘導時間依次增高,COLⅢ隨誘導時間下降,因此,本實驗獲取的BMSCs具有干細胞特性,采用適當方法可誘導其向成骨細胞分化。
　　 1.2 BMSCs成骨分化過程中神經肽CGRP、SP、NPY受體的表達
　　 CGRP受體的表達:Real Time RT-PC

16、R結果顯示同一時間點誘導組CGRP受體mRNA表達量高于未誘導組,誘導組CGRP受體mRNA表達以時間依賴性的方式不斷增高；Western Blot結果顯示同一時間點誘導組CGRP受體的蛋白水平高于未誘導組,誘導組CGRP受體蛋白水平以時間依賴性的方式增高。
　　 SP受體的表達:BMSCs及其誘導的成骨細胞有SP受體表達；SP受體mRNA在誘導1周時下降,在誘導至3周時顯著增高；同一時間點誘導組SP受體的蛋白水平高于未誘導組,

17、誘導組SP受體蛋白水平在第3周時顯著增高,呈明顯的時間依賴性。
　　 NPY受體的表達:Real Time RT-PCR結果顯示同一時間點誘導組Y1受體mRNA表達量低于未誘導組,誘導組和未誘導組Y1受體mRNA表達均以時間依賴性的方式增高。Western blot結果顯示同一時間點誘導組Y1受體的蛋白水平高于未誘導組,誘導組和未誘導組Y1受體蛋白水平以時間依賴性的方式減少。
　　 2.神經肽CGRP、SP、NPY對BM

18、SCs增殖的調控作用及其機制研究
　　 2.1神經肽CGRP、SP、NPY對BMSCs增殖作用
　　 大鼠BMSCs在三種神經肽干預的不同時間點之間OD值均有顯著性差異(F=143.271,P<0.001)。CGRP、NPY組在第1天OD值最小,之后隨培養(yǎng)時間顯著升高,至第9天達到最大值；SP、對照組在第1天OD值最小,之后隨培養(yǎng)時間顯著升高,至第7天達到最大值,在第9天時下降;干預組與干預時間存在交互效應(F=5.21

19、5,P<0.001)。各時間點的神經肽組與對照組相比OD值增高顯著,均有顯著差異(P<0.05)。其中,SP組的促大鼠BMSCs增殖效率最高。
　　 2.2細胞增殖相關調控基因表達檢測
　　 采用Western Blot技術,檢測CGRP、SP、NPY對BMSCs細胞周期素cyclinD1、cyclinE,p53基因蛋白表達的影響。CGRP組中cyclinD1蛋白表達在第5d時達到高峰,與對照組比較增高明顯,有統計學意義

20、(P<0.05)；3、5、7d的SP、NPY組與對照組相比,cyclinD1蛋白表達減少,有統計學意義(P<0.05)；CGRP、SP、NPY組促進cyclinE蛋白表達的作用均在第5d時達到高峰,有統計學意義(P<0.05)；3、5、7d的CGRP、SP、NPY組p53蛋白表達與對照組相比減少明顯,有統計學意義(P<0.05)。
　　 3.神經肽CGRP、SP、NPY對BMSCs成骨分化的作用及相關生物學機制研究
　　

21、 3.1成骨細胞特征性物質合成檢測
　　 Western Blot檢測結果:使用成骨誘導培養(yǎng)基的條件下,采用不同濃度的CGRP、SP、NPY作用于BMSCs,在7、14、21d均明顯促進ALP和BGP的蛋白表達量,同一時間的神經肽作用組與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。
　　 3.2 BMP2、VEGF表達檢測
　　 免疫細胞化學染色結果顯示:在神經肽CGRP、SP、NPY作用后的5、7d,BMP2

22、、VEGF染色陽性,胞質呈棕色。Western Blot結果顯示:第5天、第7天的三種神經肽組與對照組相比,BMP2蛋白表達增加明顯,四組間差異有統計學意義(第5天:F=292.722,P<0.001；第7天:F=1670.207,P<0.001)。其中,第七天時,CGRP組、SP組、對照組中BMP2的蛋白表達高于第5天；第7天時,NPY組中BMP2蛋白表達低于第5天,均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 第5天的三種神經肽與

23、對照組相比,VEGF蛋白表達增加明顯,四組間差異有統計學意義(F=429.338,P<0.001)。第7天時,三種神經肽組中VEGF蛋白表達高于第5天,均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4.神經肽CGRP、SP、NPY對BMSCs遷移的作用及其機制研究
　　 4.1細胞劃痕實驗觀察結果:與對照組相比,三種神經肽均能不同程度的促進BMSCs遷移,其中,以SP組7、9d的作用最強,細胞遷移的總距離和速度明顯增加。

24、>　　 4.2Transwell細胞趨化實驗結果:對照組、CGRP組、SP組、NPY組刺激組細胞遷移數分別為(1.11±0.49)、(3.20±1.77)、(4.78±1.77)、(4.86±0.96)個/高倍鏡視野,各神經肽作用組與對照組比較細胞遷移數目增加,四組間差異有統計學意義(F=20.021,P<0.001)。
　　 4.3 VCAM-1的RT-PCR檢測
　　 大鼠BMSCs在CGRP干預的不同時間點VCA

25、M-1mRNA表達均有顯著性差異(F=484.012,P<0.001)。CGRP組中VCAM-1mRNA表達具有時間依賴性,不斷遞增,在第7天時達到高峰；干預組與干預時間存在交互效應(F=683.607,P<0.001)。其中,第3天、第5天、第7天的CGRP組與對照組相比VCAM-1mRNA表達明顯增加,均有顯著性差異(P<0.05)。其他兩種神經肽均未能檢測到VCAM-1表達。
　　 結論
　　 1.BMSCs表達C

26、GRP、SP、NPY受體,在成骨分化過程中各種受體的表達趨勢各異,可能與其在骨重建過程中的不同介導作用有關。
　　 2.CGRP、SP、NPY對BMSCs的增殖有直接促進作用,通過影響cyclinD1、cyclinE、P53等細胞周期相關蛋白的表達是其可能的作用機制。
　　 3.CGRP、SP、NPY促進BMSCs向成骨細胞分化,影響成骨特征性蛋白的表達是其可能的作用機制之一。
　　 4.CGRP、SP、NPY在