降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學(xué)難題。對于從根本上提高其治療效果而言，明確骨形成、重建、塑形的病理生理學(xué)特點(diǎn)及其生物學(xué)機(jī)制是其基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。骨組織是一種伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)礦化、根據(jù)需要不斷自我修復(fù)的復(fù)雜動態(tài)組織，亦是帶有血管、神經(jīng)支配的生物活性組織，因此，骨折修復(fù)過程中既有機(jī)體多種組織、細(xì)胞因子之間錯(cuò)綜復(fù)雜的協(xié)同作用，更與血液供應(yīng)、神經(jīng)支配密切相關(guān)，其修復(fù)區(qū)域內(nèi)環(huán)境的生物學(xué)穩(wěn)定性尤其是血液供應(yīng)和神

2、經(jīng)支配的重建是關(guān)鍵因素。血液供應(yīng)的重建對于骨及移植物保持生物學(xué)活性的重要性已被眾多實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐所證實(shí)，除此之外，骨組織再生中神經(jīng)因素可能同樣發(fā)揮著重要作用。
　　 骨骼系統(tǒng)是充滿活力和不斷重建的組織，由大量感覺神經(jīng)元支配著。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)是主要的神經(jīng)遞質(zhì)。大量文獻(xiàn)證實(shí)CGRP具有促進(jìn)骨代謝作用。在骨骼發(fā)育過程中，降鈣素基因相關(guān)肽免疫陽性

3、(CGRP-immunoreactive，CGRP-IR)周圍神經(jīng)在骨形成區(qū)域非常豐富;與此一致的是，骨折愈合時(shí)，可以看到神經(jīng)纖維的生成。在成角骨折的模型中，Lietal發(fā)現(xiàn)在新骨生成特別多的區(qū)域，新形成的神經(jīng)纖維也特別豐富，其血液中CGRP濃度也增高。CGRP-IR周圍神經(jīng)在骨代謝活性的部位如干骺端、骨膜、骨軟骨結(jié)合處的生長板分布較為密集。骨組織的CGRP-IR神經(jīng)纖維的數(shù)量在骨發(fā)育和修復(fù)過程中增加，提示它們直接參與局部骨重建的調(diào)節(jié)。

4、CGRP基因敲除的小鼠表現(xiàn)為骨形成速率下降和骨丟失加速，化學(xué)和外科方法切除周圍神經(jīng)導(dǎo)致負(fù)重骨和非負(fù)重骨機(jī)械負(fù)荷能力下降。而在骨不連時(shí)，骨折殘段CGRP-IR神經(jīng)纖維明顯缺失。當(dāng)用辣椒素去除大鼠的無髓鞘感覺神經(jīng)元的CGRP時(shí)，伴隨著骨丟失和骨脆性增加。類似地，有著家族性植物神經(jīng)失調(diào)綜合征的病人，常導(dǎo)致無髓鞘神經(jīng)元的破壞伴隨著神經(jīng)肽信號的減少，骨礦密度下降和骨脆性的增加。
　　 同時(shí)骨組織也是高度血管化的組織，血管形成是骨生成和發(fā)育

5、過程中的關(guān)鍵步驟。骨骼發(fā)生及形成通過兩條不同途徑:膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。雖然是兩種不同的成骨方式，它們有著共同的特征:形成血管是它們發(fā)生的先決條件。同時(shí)有活性的微脈管系統(tǒng)的形成和發(fā)育是骨重建和骨折愈合的必需過程，血管生成在骨折后骨再生的整個(gè)過程中起著主要作用，血管生成能恢復(fù)骨折部位的血流，能通過產(chǎn)生生長因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性，募集干細(xì)胞和定向分化分成骨細(xì)胞以促進(jìn)骨形成。因此顯而易見的是，血管作為營養(yǎng)成分的主要供給者在骨的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用

6、。但是，血管不只是單單提供營養(yǎng)，有研究表明成骨祖細(xì)胞停留在人骨髓血管壁上，而當(dāng)骨折伴隨著嚴(yán)重的血管損傷，導(dǎo)致局部缺血時(shí)，會導(dǎo)致延遲愈合或不愈合。在行骨牽引時(shí)，急性牽引（產(chǎn)生過大的機(jī)械負(fù)荷）能中斷血管生成過程，阻止骨生成和導(dǎo)致纖維性不愈合。TNP-470抑制新血管的形成能阻止大鼠的骨折愈合，相反，外源性添加外來的促血管生成因子時(shí)，能顯著加速骨折愈合。
　　 而在骨組織中絕大多數(shù)CGRP-ir神經(jīng)纖維與血管伴行。我們實(shí)驗(yàn)室在前期研究

7、發(fā)現(xiàn)植入周圍神經(jīng)能促進(jìn)組織工程骨成骨及修復(fù)骨缺損，骨缺損部位的神經(jīng)肽明顯增加，且感覺神經(jīng)束植入的組織工程骨內(nèi)可見較多血管。由于CGRP-ir周圍神經(jīng)和血管生成在骨發(fā)育和修復(fù)中都具有不可或缺的作用。因此，周圍神經(jīng)和血管在骨修復(fù)及重建中有著什么樣的關(guān)系？周圍神經(jīng)是否可通過促進(jìn)骨組織的血管生成進(jìn)一步促進(jìn)骨修復(fù)和重建？本實(shí)驗(yàn)研究的是周圍神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽CGRP對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制研究，以進(jìn)一步明確周圍神經(jīng)在骨組織中的作用。

8、>　　 研究目的
　　 神經(jīng)肽CGRP受體在HUVECs上的表達(dá)特點(diǎn)
　　 明確神經(jīng)肽CGRP調(diào)控HUVECs增殖和遷移的作用及其機(jī)制。
　　 初步探明神經(jīng)肽CGRP在HUVECs血管生成中的生物效應(yīng)及機(jī)制。
　　 比較CGRP與VEGF體外促HUVECs增殖、遷移、成管的作用大小
　　 第1部分人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取、鑒定以及其表面CGRP受體的表達(dá)
　　 目的:
　　 獲

9、取用于作為種子細(xì)胞的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，并對臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)記蛋白以及細(xì)胞上CGRP受體進(jìn)行鑒定
　　 方法:
　　 1.人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取、鑒定
　　 用胰酶消化新生兒剖宮產(chǎn)臍帶，用含20％FBS的內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基EMG-2在37°5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)消化下來的細(xì)胞，對細(xì)胞行形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察以及采用細(xì)胞免疫熒光對血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。
　　 2.臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞上

10、CGRP受體的檢測
　　 HUVECs在蓋玻片上生長融合為單層后，以4％多聚甲醛固定30min，正常山羊血清封閉30min，分空白對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加CGRP1受體，空白對照組不加CGRP1受體，置于濕盒中4℃過夜，加入DyLight594標(biāo)記的山羊抗兔IgG，置于37℃中30min，以5μg/mLDAPI染核10min，緩沖甘油封片，于倒置熒光相差顯微鏡下觀察。
　　 結(jié)果:
　　 成功分離培養(yǎng)出臍靜脈血管

11、內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)鑒定符合血管內(nèi)皮細(xì)胞特征，CGRP受體存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞上。
　　 結(jié)論:
　　 胰酶消化培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞為臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞存在有CGRP受體。實(shí)驗(yàn)證實(shí)CGRP受體存在于臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)上，從而為進(jìn)一步研究CGRP對血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用提供理論依據(jù)。
　　 第2部分降鈣素基因相關(guān)肽對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制研究
　　 目的:
　　

12、探討降鈣素基因相關(guān)肽（calcitoningene-relatedpeptide，CGRP）對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)增殖與遷移的作用，進(jìn)一步揭示組織工程骨的神經(jīng)化促血管生成機(jī)制。
　　 方法:
　　 取第1代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組分為6組，分別以0(A組)、1×10-12（B組）、1×10-11（C組）、1×10-10（D組）、1×10-9

13、（E組）、1×10-8mol/L組（F組）濃度CGRP干預(yù)HUVECs。采alarmarBlue法動態(tài)檢測各組HUVECs增殖率，Transwell小室檢測各組HUVECs的遷移能力，ELISA法檢測HUVECs分泌VEGF的水平，Q-PCR以及Westernblot法監(jiān)測其局部粘著斑激酶（focaladhesionkinase，F(xiàn)AK）的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 CGRP呈時(shí)間-濃度依賴性刺激HUVECs增殖。不同濃

14、度組之間細(xì)胞增殖率有顯著性差異(F=129680，P=0.000)，在6個(gè)組均如此，F(xiàn)值分別為38849.2，25249.5，35031.7，23215.1，8192.9，66171.5，均為P＜0.001;從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的細(xì)胞增殖率均有顯著性差異(F=1066.5，P=0.000)，在五個(gè)時(shí)間點(diǎn)均如此，F(xiàn)值分別為142.89，318.18，247.89，338.55，187.62，均為P＜0.001，不同時(shí)間點(diǎn)與分組間存

15、在著交互效應(yīng)(F=37.777，P=0.000);B～F組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率均高于A組(P＜0.001)，F(xiàn)組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率最高。B～F組遷移細(xì)胞數(shù)均顯著高于A組(F=732.32，P＜0.001)，最大增幅達(dá)3倍以上。B～F組VEGF分泌量均顯著高于A組(F=208.53，P＜0.001);C，D組促進(jìn)細(xì)胞分泌VEGF的能力最強(qiáng)。Q-PCR與Westernblot檢測示，與A組相比，B～F組CGRP刺激HUVECs3、7、10d后

16、，F(xiàn)AK表達(dá)明顯增加。不同濃度組之間FAK的表達(dá)有顯著性差異(F=30.12，P=0.000)，在6個(gè)組均如此，F(xiàn)值分別為68.60，344.58，1458.82，183.35,674.70,63.13，均為P＜0.001;從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的FAK的表達(dá)均有顯著性差異(F=20.01，P=0.000)，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均如此，F(xiàn)值分別為219.41,637.16，774.41，均為P＜0.001，不同時(shí)間點(diǎn)與分組間存在著交互效應(yīng)

17、(450.10，P=0.000)
　　 結(jié)論:
　　 CGRP對HUVECs的增殖和遷移有直接促進(jìn)作用，CGRP促進(jìn)VEGF分泌和增加FAK的表達(dá)與此密切相關(guān)。
　　 第3部分CGRP促HUVECs體外血管生成的作用及其生物學(xué)機(jī)制
　　 目的:
　　 觀察降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin-gene-relatedpeptide，CGRP)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalv

18、einendothelialcells，HUVECs)成血管作用，并探討其生物學(xué)機(jī)制。
　　 方法:
　　 體外分離獲取HUVECs，采用體外成管實(shí)驗(yàn)檢測CGRP的血管生成作用，采用ELISA法檢測CGRP直接/間接作用于HUVECs時(shí)，VEGF的分泌水平。Q-PCR檢測CGRP刺激細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)，VEGF、VEGF受體1(FLT1)、VEGF受體2(KDR)及CGRP受體1的mRNA表達(dá)，Westernblot檢測H

19、UVECs的FLT1、KDR的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 體外成管實(shí)驗(yàn)顯示CGRP有明顯的促血管生成作用(F=531.61，P=0.000)。ELISA顯示CGRP能促進(jìn)HUVEC分泌VEGF。Q-PCR示CGRP促VEGFmRNA表達(dá)升高，不同濃度組之間VEGFmRNA的表達(dá)有顯著性差異(F=18097，P=0.000)，在6個(gè)組均如此，F(xiàn)值分別為6081.3，1913.7，2269.0，3599.8，4252.9

20、，4561.9，均為P＜0.001;從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的VEGFmRNA均有顯著性差異(F=1324，P=0.000)，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均如此，F(xiàn)值分別為241.6，370.3，944.2，均為P＜0.001，不同時(shí)間點(diǎn)與分組間存在著交互效應(yīng)(4234.57，P=0.000)。
　　 CGRP同樣能促進(jìn)CGRPRmRNA的表達(dá)的增加，不同濃度組之間CGRPRmRNA的表達(dá)有顯著性差異(F=5430，P=0.000)，在6個(gè)

21、組均如此，F(xiàn)值分別為3160.9，2218.4，7922.8，14390，880.6，72.35，均為P＜0.001;從各時(shí)間點(diǎn)看，每一時(shí)間點(diǎn)各組的CGRPRmRNA的表達(dá)均有顯著性差異(F=2493，P=0.000)，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均如此，F(xiàn)值分別為523.3，2994.8，1064.1，均為P＜0.001，不同時(shí)間點(diǎn)與分組間存在著交互效應(yīng)(F=478.7，P=0.000)。且在第10天時(shí)最為明顯。而(10-12～10-8M)CGRP組

22、的FLT1mRNA與KDRmRNA表達(dá)在3d、7d、10d時(shí)均比對照組高(P＜0.001)。Westernblot結(jié)果顯示(10-12～10-8M)CGRP組能顯著促進(jìn)HUVECs表達(dá)FLT1，KDR。
　　 結(jié)論:
　　 CGRP能明顯促進(jìn)HUVECs的體外生成血管，可能與其促進(jìn)VEGF分泌，增強(qiáng)HUVECs的FLT1與KDR表達(dá)有關(guān);且同時(shí)，CGRP的受體表達(dá)也增加，可進(jìn)一步增強(qiáng)CGRP的促血管生成作用。
　　

23、 第4部分CGRP與VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管作用的比較
　　 目的:
　　 比較降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）對血管內(nèi)皮細(xì)胞殖、遷移、體外成管的作用。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)分9組，(10-12-10-8)MCGRP，(5-20ng/ml)VE

24、GF165，另設(shè)置一個(gè)空白對照組。采用細(xì)胞免疫熒光觀察HUVECs的CGRP受體(calcitoningene-relatedpeptidereceptors，CGRPR)表達(dá)情況，alarmarBlue法動態(tài)檢測各組HUVECs的增殖率，Transwell小室檢測各組HUVECs的遷移能力。采用體外成管實(shí)驗(yàn)檢測各組促血管生成作用大小。Q-PCR檢測CGRP和VEGF165刺激細(xì)胞時(shí)，CGRP受體的mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果

25、:
　　 CGRP及VEGF165時(shí)間-濃度依賴性促進(jìn)HUVECs增殖，VEGF165促內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力強(qiáng)于CGRP，差異有顯著性(F=63.39，P=0.000)。CGRP及VEGF165都能明顯促進(jìn)HUVECs遷移(F=609，P=0.000)及促進(jìn)HUVECs在基質(zhì)膠中形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)(F=348.8，P=0.000)。CGRP與VEGF促細(xì)胞遷移(P=0.124)及促成管(P=0.449)的最大作用無顯著性差異。CG