骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及對(duì)膠質(zhì)瘤的趨向效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病中膠質(zhì)瘤的發(fā)病率最高，約占40～50％。盡管臨床的綜合治療方案能產(chǎn)生一些療效，但膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然很差?；蛑委煹某霈F(xiàn)為我們展示了良好的前景。但由于病毒載體自身毒性、目的基因表達(dá)周期短、靶向性問(wèn)題、免疫源性或者不能選擇到合適的追蹤浸潤(rùn)瘤細(xì)胞載體等原因，在I期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)都未能取得預(yù)期的療效。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為一種新型的載體出現(xiàn)引起了科學(xué)工作者的關(guān)注，它培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單成熟，具有多向分化潛能和定向遷移能力，而且外源性基因表達(dá)穩(wěn)

2、定，來(lái)源安全可靠，沒(méi)有倫理學(xué)困擾，因此能夠選作為種子細(xì)胞進(jìn)行靶向治療。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定分化等生物學(xué)特性研究是各項(xiàng)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，也是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在體內(nèi)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化的比例相當(dāng)?shù)汀＿@就需要給予合適的誘導(dǎo)策略增加其神經(jīng)方向的分化率。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)有絲分裂等生物學(xué)作用較顯著。體內(nèi)研究中由于外源性因子的導(dǎo)入困難，而應(yīng)激條件下被激活的內(nèi)源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)有限，所以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分

3、化為神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)整合受傷的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能有限，因此將相關(guān)基因?qū)牍撬杌|(zhì)干細(xì)胞使其能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)有助于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能夠選擇性趨向體內(nèi)各損傷部位，他的這種歸巢性被認(rèn)為是其發(fā)揮腫瘤治療作用的重要基礎(chǔ)。而且骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能夠通過(guò)多種機(jī)制治療腦腫瘤。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外所處環(huán)境與體內(nèi)微環(huán)境不同，目前在體外模擬體內(nèi)環(huán)境條件下干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞趨向效應(yīng)的研究較少?？紤]到未來(lái)臨床使用的可操作性問(wèn)題，應(yīng)該選擇經(jīng)何種途徑移植干細(xì)胞

4、治療膠質(zhì)瘤才能達(dá)到最大效果。在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程中常有一些相關(guān)特異性因子參與，這些因子的表達(dá)變化可以作為膠質(zhì)瘤治療效果的評(píng)估指標(biāo)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3被認(rèn)為是腦惡性腫瘤糖代謝的第一個(gè)限速因子，缺氧誘導(dǎo)因子-1α是惡性腫瘤參與腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞代謝、凋亡的重要核轉(zhuǎn)錄因子。目前對(duì)這幾種因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的共同表達(dá)研究甚少?；诖耍覀冞M(jìn)行以下研究。
　　第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究
　　目的：研究骨

5、髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法：對(duì)BMSCs進(jìn)行體外分離培養(yǎng)誘導(dǎo)分化,并免疫組化，流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光鑒定。構(gòu)建bFGF過(guò)表達(dá)載體并測(cè)序，慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染BMSCs,分別在體外體內(nèi)通過(guò)形態(tài)學(xué)，免疫組化，免疫熒光，westernblot，PCR，觀察bFGF基因修飾后的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化及遷移效應(yīng)的情況。結(jié)果：BMSCs分離接種24h后，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，3d以后，進(jìn)入細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。1W左右，可觀察到細(xì)胞逐漸增多并形成突起相互聯(lián)系，

6、生長(zhǎng)速度減慢。培養(yǎng)12d后，細(xì)胞達(dá)到融合成片鋪滿(mǎn)瓶底。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量與未經(jīng)誘導(dǎo)組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD44，CD29，CD90,CD105染色的細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色。CD44陽(yáng)性細(xì)胞率為92.0±3.2％，CD29陽(yáng)性細(xì)胞率為94.6±4.8％,而CD45，CD11b,CD34染色的細(xì)胞胞內(nèi)幾乎沒(méi)有表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記可見(jiàn)CD90為99.64％，CD34為1.23％，CD44為99.

7、54％，CD11b為0.43％；BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化3d后表達(dá)Nestin抗原，7d后細(xì)胞表現(xiàn)出典型的神經(jīng)元樣改變，檢測(cè)到來(lái)源于BMSCS的部分細(xì)胞可分別表達(dá)NeuN和GFAP。NSE、NeuN、GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的比例在培養(yǎng)的早期隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多。但到1W后，比例逐漸降低。經(jīng)誘導(dǎo)的組別的NeuN陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組（P＜0.05）。載體構(gòu)建和病毒包裝實(shí)驗(yàn)中，篩選酶切后得到pUC57-SL08重組質(zhì)粒酶切后的SL08片段。將

8、SL08片段克隆入pLenti6/V5-D-TOPO得到pLenti6-SL08重組質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，鑒定成功構(gòu)建bFGF的過(guò)表達(dá)載體，慢病毒滴度定量測(cè)得為3×107v.p./ml。pLenti6-SL08轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞48h后，通過(guò)Westernblot與RT-PCR檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組均有bFGF基因的表達(dá)，bFGF基因修飾的BMSCs組中bFGF表達(dá)效果最明顯。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，基因轉(zhuǎn)染后BMSCs各組細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞數(shù)

9、量開(kāi)始增加，48至72小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)量均顯著增多，pLenti6-SL08組細(xì)胞數(shù)量多于其他兩組，但各組間數(shù)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)，7天左右均可見(jiàn)有明顯神經(jīng)元樣改變細(xì)胞出現(xiàn)，此時(shí)三組細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)均顯著放緩，但是pLenti6-SL08組細(xì)胞數(shù)量顯著多于其他兩組(P＜0.05)，其他兩組間細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，pLenti6-SL08組CD9096.44％，CD340.61％，BMSCs-2組CD44

10、99.95％，CD11b0.73％。細(xì)胞體外培養(yǎng)到一周后，3組細(xì)胞均見(jiàn)大部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯神經(jīng)元樣改變。pLenti6-SL08組神經(jīng)元樣改變細(xì)胞數(shù)量與其他兩組比有顯著差異(P＜0.05)。pLenti6-SL08載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞48h后，通過(guò)Westernblot與RT-PCR檢測(cè)bFGF表達(dá)，證明經(jīng)bFGF修飾的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組的bFGF基因表達(dá)明顯強(qiáng)于其他兩組，轉(zhuǎn)染結(jié)果可靠。培養(yǎng)7天后免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞中均可

11、見(jiàn)Nestin,NeuN,GFAP的表達(dá)。pLenti6-SL08組細(xì)胞的Nestin,NeuN表達(dá)顯著多于其他兩組(P＜0.05)。Westernblot檢測(cè)pLenti6-SL08組Nestin,NeuN均顯著高于其他兩組(P＜0.05)，而其他兩組間Nestin,NeuN的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。腦創(chuàng)傷體內(nèi)模型中，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：各時(shí)間點(diǎn)損傷側(cè)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞多于對(duì)側(cè)(P<0.001)，而且經(jīng)bFGF修飾BMSCs組

12、在各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞均多于未經(jīng)修飾組(P<0.001)；1W后所檢出的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始減少，但在損傷同側(cè)部位bFGF修飾BMSCs組降低幅度要小的多(P=0.08)。Westernblot檢測(cè)各組腦組織不同時(shí)間點(diǎn)bFGF的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)bFGF表達(dá)有顯著差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組bFGF7d時(shí)明顯增高(P＜0.05)，14d時(shí)雖下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(P=0.12)；對(duì)照組bFGF7d時(shí)明顯增高(P＜0.05)，14

13、d時(shí)顯著下降(P＜0.05)；各時(shí)間點(diǎn)bFGF在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組(P＜0.05)。免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩組干細(xì)胞移植到腦內(nèi)后均可以表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記的BrdU,并且同樣能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比例遠(yuǎn)大于神經(jīng)元。同側(cè)腦室、皮質(zhì)區(qū)域可見(jiàn)BMSCs組和bFGF修飾BMSCs組均有大量BMSCs分布，兩組間有顯著差異(P＜0.05)；在同側(cè)腦室、皮質(zhì)區(qū)域可見(jiàn)bFGF修飾BMSCs組干細(xì)胞分化為神經(jīng)元顯著多于BMS

14、Cs組(P＜0.05)。結(jié)論：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)可以得到高純度的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，bFGF修飾的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外均能穩(wěn)定持續(xù)地增殖和神經(jīng)細(xì)胞方向的分化，而且能更顯著地向腦外傷后的損傷部位遷移。
　　第二部分骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向效應(yīng)
　　目的：研究骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外和體內(nèi)向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)。方法：通過(guò)免疫組化，Westernblot評(píng)估GLUT-3、HIF-1α是否可作為評(píng)估膠

15、質(zhì)瘤生物學(xué)行為的指標(biāo)之一。然后模擬體內(nèi)環(huán)境，采用Transwell、MTT、平板克隆等方法觀察預(yù)處理的BMSCs對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向、抑制等方面效應(yīng)，然后構(gòu)建大鼠C6膠質(zhì)瘤模型，經(jīng)不同途徑移植BMSCs，通過(guò)行為學(xué)，形態(tài)學(xué)，組織病理學(xué)，分子生物學(xué)等方法觀察BMSCs對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向、抑制效應(yīng)。結(jié)果：免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GLUT-3、HIF-1α其表達(dá)強(qiáng)度隨膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)增加而升高(P＜0.001)。westernblot檢測(cè)兩者的表達(dá)

16、與免疫組化結(jié)果相似。體外實(shí)驗(yàn)部分：我們觀察到C6細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，傳代后細(xì)胞增殖速度依然很快。在Transwell共培養(yǎng)體系中預(yù)處理和未經(jīng)預(yù)處理的BMSCs分別與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，HE染色方法發(fā)現(xiàn)兩組小室內(nèi)膜上均有大量細(xì)胞通過(guò)，實(shí)驗(yàn)組通過(guò)小孔的細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組(P<0.001)。MTT結(jié)果顯示用含有普通骨髓基質(zhì)干細(xì)胞上清液培養(yǎng)的C6細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度明顯高于預(yù)誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞上清液培養(yǎng)的C6細(xì)胞組(P＜0.05)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

17、，對(duì)照組上清液培養(yǎng)的C6細(xì)胞形成的克隆數(shù)多于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。這兩組用Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)預(yù)處理骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液組GLUT-3和HIF1α表達(dá)明顯被抑制(P＜0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):發(fā)現(xiàn)對(duì)照組最早出現(xiàn)顱內(nèi)壓增高癥狀癥狀，且很快加重，BMSC-1組最晚出現(xiàn)以上癥狀。對(duì)照組第3天時(shí)即開(kāi)始出現(xiàn)死亡病例，BMSC-1組存活時(shí)間最長(zhǎng)為45天,各組生存率有顯著差異(P＜0.05)。HE發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞十分密集，向正常腦組織浸潤(rùn)，正常

18、組織區(qū)別明顯，細(xì)胞小核大，多見(jiàn)核分裂相，有明顯的癌巢。對(duì)照組腫瘤體積最大，經(jīng)腦室組最小(P＜0.05)。BrdU免疫組化染色結(jié)果顯示:骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在通過(guò)側(cè)腦室移植入鼠腦膠質(zhì)瘤模型后，干細(xì)胞在腦室周?chē)芎秃ｑR等處分布較明顯，主要集中在膠質(zhì)瘤的邊緣部位或與臨近組織處交接范圍。腫瘤同側(cè)半球中的表達(dá)高于腫瘤內(nèi)部表達(dá)(P<0.001)。同側(cè)半球分布明顯多于對(duì)側(cè)半球分布(P<0.001)。經(jīng)尾靜脈途徑移植組發(fā)現(xiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在腫瘤所

19、在半球的血管和腫瘤周邊，在腫瘤內(nèi)、腦室附近及對(duì)側(cè)半球極少,腫瘤同側(cè)半球中的表達(dá)多于腫瘤內(nèi)部表達(dá)（P<0.001），同側(cè)半球分布明顯多于對(duì)側(cè)半球分布(P<0.001)。兩組相比較，經(jīng)側(cè)腦室移植途徑腫瘤內(nèi)部BrdU陽(yáng)性細(xì)胞多于尾靜脈途徑移植組（P<0.001）在腫瘤同側(cè)半球的陽(yáng)性細(xì)胞也明顯多于尾靜脈途徑移植組(P<0.001)，對(duì)側(cè)半球陽(yáng)性細(xì)胞也多于尾靜脈組(P<0.001)。Westernblot檢測(cè)顯示在BMSCs-1、BMSCs-2組

20、及對(duì)照組中GLUT-3，HIF1α的表達(dá)分別成遞增趨勢(shì)(P＜0.05)。RT-PCR檢測(cè)與Westernblot相似，GLUT-3和HIF1α的表達(dá)也均成遞增趨勢(shì)(P＜0.05)。結(jié)論：初步證實(shí)了GLUT-3和HIF1α是參與膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的重要因子，在體外經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向性更強(qiáng)，可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，降低GLUT-3和HIF1α的表達(dá)，體內(nèi)經(jīng)腦室移植途徑干細(xì)胞能更多地向膠質(zhì)瘤遷移，能明顯抑制瘤體增大