IGFBPrP1對SD大鼠及比格犬肺組織的影響及意義.pdf

1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(insulin-like growth factor binding protein-related protein1， IGFBPrP1）即胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein7，IGFBP7），廣泛分布于正常人體各組織器官，能調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附、血管形成和刺激前列腺素合成，在多種組織細胞的增殖、分化、衰老、凋亡等病理生理過

2、程中起重要作用。導師課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IGFBPrP1是一種新的致肝纖維化因子，可刺激肝組織產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor beta1，TGFβ1），與TGFβ1相互調(diào)節(jié)，互為因果，共同促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。TGFβ1屬TGFβ超家族，具有多重生物學作用，如調(diào)節(jié)細胞發(fā)育、黏附、遷移、免疫應答、創(chuàng)傷修復、炎癥以及細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的生成及降解等，是目

3、前公認的最強致纖維化因子，與肝、肺纖維化密切相關(guān)。因此推測IGFBPrP1可能對肺組織亦有影響。目前類似報道鮮見，為此本實驗采用尾靜脈注射攜帶IGFBPrP1基因的腺病毒載體至SD大鼠及硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）皮下注射比格犬構(gòu)建肝纖維化動物模型，研究IGFBPrP1對肺組織的影響及其意義。
　　目的：
　　探討IGFBPrP1對SD大鼠及比格犬肺組織的作用及其可能機制。
　　方法：
　　1

4、、60只健康清潔級雄性SD大鼠，5~6w齡，體重120~150 g，隨機分為3組：
　　A組（n=10）：即正常對照組，尾靜脈單次注射同等劑量0.9％NaCl注射液；
　　B組（n=25）：即Ad-EGFP組，尾靜脈單次注射腺病毒包裝的增強型綠色熒光蛋白（adenovirus-enhanced green fluorescent protein，Ad-EGFP）4×109 pfu/只；
　　C組（n=25）：即Ad-I

5、GFBPrP1組，尾靜脈單次注射腺病毒包裝的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1（adenovirus-insulin-like growth factor binding protein-related protein1，Ad-IGFBPrP1）4×109 pfu/只。
　　各組大鼠分別于注射腺病毒后1w、2w、4w、6w、9 w末行乙醚吸入麻醉，留取左肺葉待測。
　　2、18只8月齡健康雄性比格犬，體重9~11kg，隨機分

6、為3組：
　　D組（n=6）：即正常組，正常飼養(yǎng)12w，未予特殊處理；
　　E組（n=6）：即TAA組，予TAA皮下注射12mg/kg/只，每周2次，持續(xù)12w；
　　F組（n=6）：即TAA+IGFBPrP1抗體組，予TAA皮下注射12 mg/kg/只，每周2次，持續(xù)12w，5w起同時予門靜脈注射IGFBPrP1抗體，5μg/kg/只，每周1次。
　　于12w末行1.5%戊巴比妥鈉靜脈麻醉，留取各犬肺組織待測。

7、
　　課題組前期實驗已證實采用以上C組及E組相同處理方法可成功誘導SD大鼠及比格犬肝纖維化。
　　行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察SD大鼠及比格犬肺組織病理形態(tài)學變化；苦味酸-天狼猩紅染色（Sirius Red staining）觀察SD大鼠及比格犬肺組織膠原纖維形成情況；免疫組織化學染色（immunohistochemical staining，IHC）檢測SD大鼠肺組織

8、IGFBPrP1、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、TGFβ1、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）以及比格犬肺組織IGFBPrP1的分布及表達。
　　結(jié)果：
　　1.SD大鼠：
　　1.1.HE染色結(jié)果：
　　正常組及Ad-EGFP組各大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰；Ad-IGFBPrP1組轉(zhuǎn)染1w時，部分肺泡腔出現(xiàn)少量炎性細胞；轉(zhuǎn)染2w時炎細胞侵及肺泡間隔及支氣管壁，并伴有少量支氣管

9、纖毛柱狀上皮細胞（即支氣管粘膜上皮細胞）脫落；4w時，肺泡腔、肺泡間隔及支氣管周圍有大量炎細胞浸潤，同時部分肺泡壁、肺泡間隔開始增厚、增寬；轉(zhuǎn)染6w時炎細胞逐漸減少，肺泡間隔、肺泡壁逐漸增厚；9w時肺泡壁、肺泡間隔顯著增寬，膠原纖維增多，甚至出現(xiàn)部分肺組織結(jié)構(gòu)破壞。
　　1.2.Sirius Red染色結(jié)果：
　　與正常對照組及Ad-EGFP組相比，Ad-IGFBPrP1組大鼠隨IGFBPrP1作用時間延長，肺組織血管壁、支

10、氣管壁及肺泡間隔紅染膠原纖維逐漸增多，9w最甚。與正常對照組、Ad-EGFP組及Ad-IGFBPrP1組1w、2w、4w、6w相比， Ad-IGFBPrP1組9w肺組織膠原纖維顯著增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　1.3.免疫組織化學染色結(jié)果：
　　(1) IGFBPrP1：正常對照組及Ad-EGFP組中IGFBPrP1僅少量于支氣管纖毛柱狀上皮細胞胞漿表達，染色呈淡黃色；Ad-IGFBPrP1組在支氣管纖毛柱

11、狀上皮細胞、巨噬細胞胞漿可見IGFBPrP1大量表達，呈棕黃色。與正常對照組、Ad-EGFP組和Ad-IGFBPrP1組1w、9w相比，Ad-IGFBPrP1組2w、4w、6w的IGFBPrP1蛋白表達量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　(2) IL-1β：正常對照組及Ad-EGFP組中僅在個別巨噬細胞胞漿中可見IL-1β的表達；Ad-IGFBPrP1組各時間點巨噬細胞胞漿IL-1β表達量明顯增多，呈棕褐色顆粒。

12、與正常對照組、Ad-EGFP組和Ad-IGFBPrP1組1w、9w相比，Ad-IGFBPrP1組2w、4w、6w的IL-1β蛋白表達量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　(3) TGFβ1：TGFβ1表達部位與IGFBPrP1相同。與正常對照組、Ad-EGFP組相比， Ad-IGFBPrP1組1w、2w、4w、6w、9w的TGFβ1蛋白表達量增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　(4) FN：正常對

13、照組及Ad-EGFP組中FN僅少量表達于支氣管纖毛柱狀上皮細胞胞漿，染色淡；Ad-IGFBPrP1組于支氣管纖毛柱狀上皮細胞及支氣管周間質(zhì)細胞胞漿可見FN大量表達。與正常對照組、Ad-EGFP組及Ad-IGFBPrP1組1w、2w、4w、6w相比，Ad-IGFBPrP1組9w的FN蛋白表達量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　2.比格犬：
　　2.1.HE染色結(jié)果：
　　正常組比格犬肺組織結(jié)構(gòu)完整，無炎

14、性改變及膠原沉積。TAA組比格犬肺泡腔、肺泡間隔及支氣管周圍有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁、肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞。TAA+IGFBPrP1抗體組病變程度較TAA組顯著減輕。
　　2.2.Sirius Red染色結(jié)果：
　　正常組比格犬肺組織血管壁、支氣管壁可見少量紅染膠原纖維；TAA組肺組織血管壁、支氣管壁紅染膠原纖維增多，肺泡間隔可見膠原沉積， TAA+IGFBPrP1抗體組紅染膠原纖維較TAA組少，較正常組多，

15、差異均具統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　2.3.免疫組織化學染色結(jié)果：
　　IGFBPrP1在TAA組（1.39±0.20）、TAA+IGFBPrP1抗體組（1.05±0.16）的表達較正常組（0.50±0.14）明顯增多，TAA+IGFBPrP1抗體組IGFBPrP1蛋白表達較TAA組減少，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.腺病毒介導的IGFBPrP1對SD大鼠肺組織有炎性損傷甚至

16、促纖維化作用， IGFBPrP1在TAA誘導比格犬肺組織炎性損傷及纖維化過程中發(fā)揮了部分作用；
　　2. IGFBPrP1可能是一種無組織器官特異性的致病因子。
　　2.2.Sirius Red染色結(jié)果：
　　正常組比格犬肺組織血管壁、支氣管壁可見少量紅染膠原纖維；TAA組肺組織血管壁、支氣管壁紅染膠原纖維增多，肺泡間隔可見膠原沉積， TAA+IGFBPrP1抗體組紅染膠原纖維較TAA組少，較正常組多，差異均具統(tǒng)計學意

17、義（P<0.01）。
　　2.3.免疫組織化學染色結(jié)果：
　　IGFBPrP1在TAA組（1.39±0.20）、TAA+IGFBPrP1抗體組（1.05±0.16）的表達較正常組（0.50±0.14）明顯增多，TAA+IGFBPrP1抗體組IGFBPrP1蛋白表達較TAA組減少，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.腺病毒介導的IGFBPrP1對SD大鼠肺組織有炎性損傷甚至促纖維化作用，